羊草 14-3-3基因的克隆及序列分析

趙 英 ，劉晶瑩，楊夢丹，汪自慶，麻鵬達

(1.西北農林科技大學 理學院，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

14-3-3蛋白是由一個基因編碼的一類調控蛋白。1976年由Moore和Perez在牛的腦組織中發現的一種酸性蛋白質，經過二乙胺已基纖維素柱分離組分的片段數目和凝膠電泳遷移的位置等將其命名為14-3-3蛋白[1]。經過大量研究證實，14-3-3是一個十分保守的同型二聚體和異型二聚體蛋白分子家族，廣泛分布于真核生物細胞中，且與其他蛋白質結合共同調控生理機制[2]。14-3-3蛋白的晶體結構分析表明，14-3-3蛋白含有2個亞基且反向平行，在每個亞基中至少含有9個α-螺旋，這種凹槽結構可以結合靶蛋白。14-3-3蛋白不同的異構體N端和C端也有明顯變化，N端影響14-3-3蛋白與膜的結合，而C端參與14-3-3蛋白與靶蛋白的相互作用[3]。14-3-3蛋白結構的特點決定了其在生理生化方面的作用，研究表明在代謝調節、酶活性以及細胞定位和轉錄調控等方面均有影響[4]。

14-3-3是高度保守的存在于真核生物中的蛋白質，參與調解多種細胞中的酶，包括蛋白激酶[4-5]，如14-3-3蛋白可以綁定和調節蛋白激酶C[6]和Raf激酶[7]。此外，14-3-3蛋白還會綁定wee1激酶[8]。在植物中，14-3-3蛋白調控硝酸還原酶和H+泵[9-10]。在細胞質酶調控中，14-3-3蛋白是重要的局部膜蛋白，特別是在細胞離子泵和通道蛋白的直接和間接調控上，結合14-3-3蛋白可以提高或者抑制離子泵的活性，例如14-3-3蛋白與ATP合酶復合體就是抑制了F型離子泵的活性[11]。通過化學發光法，Bunney等[12]發現在抑制14-3-3蛋白表達的轉基因馬鈴薯中抗氧化活性比對照馬鈴薯要高45%。另有研究表明[13]，在棉花中過表達14-3-3λ，會與膜表面的H+-ATPase或者向光素相互作用，從而影響保衛細胞氣孔的關閉。

羊草(Leymuschinensis)是歐亞溫帶草原的優勢物種，對環境有極強的適應性，對研究土地沙化及耐鹽性具有很大意義[14]。14-3-3蛋白在羊草抗生物脅迫中的作用是未知的。通過RACE技術由已知的cDNA序列擴增3′端和5′端的方法已經應用的很普遍。如Li等[15]通過RACE技術克隆刺參的全長cDNA，得到開放閱讀框為579 bp編碼192個氨基酸的AjRAC1蛋白。謝歡等[16]使用RACE技術得到TcLr24小麥NBS-LRR同源基因[16]。本研究通過NCBI找到EST序列并設計引物，使用RACE技術獲得該基因的3′UTR區，進行序列拼接得到全長cDNA。通過DNAMAN和MEGA進行同源序列比對、構建進化樹及分析開放閱讀框和編碼該蛋白質的氨基酸序列進一步確認該基因編碼14-3-3蛋白。通過RT-PCR檢測 14-3-3在各組織及200 mmol/L NaCl、100 mmol/L Na2CO3和20%PEG 6000脅迫下的表達量，進一步分析14-3-3蛋白在羊草中的功能，為進一步應用該基因進行植物的耐鹽性遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

羊草種子于蛭石中萌發，用1/2 MS培養基每3 d澆灌1次至長至4葉期，在光照16 h，室溫25 ℃條件下培養。

1.2 羊草RNA的提取及反轉錄

采用天根RNAprep Pure試劑盒提取羊草RNA，用Nanodrop檢測提取的總RNA濃度并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。使用TaKaRa PrimeScriptTMRTReagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉錄，并使用Nanodrop分析反轉錄的cDNA濃度，并把模板質量濃度稀釋為200.0 ng/μL。

1.3 RACE和全長cDNA克隆

在Genebank中檢索到羊草14-3-3蛋白的EST序列(登錄號：CD808769)，通過BLASTX對比，發現該序列為羊草14-3-3蛋白基因的5′端。根據羊草14-3-3蛋白的EST序列通過Primer 5.0設計3′RACE的特異性引物：5′-CACTGCCCCTGAGTCCAAG-3′。PCR反應體系參照Clontech公司的RACE試劑盒說明。通過DNAMAN拼接序列從而得到羊草14-3-3蛋白的全長cDNA。

1.4 14-3-3基因表達檢測

通過400 mmol/L NaCl、100 mmol/L Na2CO3和20% PEG 6000脅迫處理，分別在0、6、12和24 h時間點取脅迫處理后的羊草葉片及未進行脅迫處理的幼嫩羊草的根和葉片為材料，通過RT-PCR進行 14-3-3 在轉錄水平表達特性的研究。設計特異性引物F1(5′-TGTGAAGATGTCGGCACCA-3′)和R1(5′-AACCATAACACGGCTACGAC-3′)對第1條cDNA鏈進行擴增。并以actin基因為內參基因，根據序列通過Primer 5.0設計RT-PCR引物：F2 5′-GCACGAGGGAGGAAACCAG-3′，R2：5′-GTCATCGACAGTAGCAACCAC-3′，擴增程序為94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，58 ℃，45 s，72 ℃，1 min，35 個循環；72 ℃，4 min。通過瓊脂糖凝膠電泳分析基因的表達。

1.5 系統發育樹及蛋白理化性質分析

通過NCBI( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中“Align two(or more) sequences using BLAST(bl2seq)”對3′RACE的結果和羊草EST序列進行拼接。根據拼接后的序列設計特異性引物進行羊草 14-3-3基因cDNA全長的擴增，用TA克隆對PCR產物進行序列測定，通過NCBI“ORF finder”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找該序列的開放閱讀框。根據羊草14-3-3序列，在NCBI中通過BLAST進行序列對比，分析序列的同源性。通過DNAMAN 8.0進行多序列比對，MEGA 5.0構建系統進化樹，軟件對序列聯配對比結果采用連接法(Neighbor-Joining，NJ)重復1 000次。通過http://web.expasy.org/protparam/,分析羊草14-3-3蛋白序列。通過http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html對羊草的三級結構進行預測。

2 結果與分析

2.1 羊草14-3-3全長cDNA的獲得

3′RACE的產物通過TA克隆，得到長為175 bp的3′末端，將3′ RACE擴增序列與羊草14-3-3 EST序列進行拼接，根據拼接序列設計引物進行全長cDNA的擴增，擴增產物經測序長為1 048 bp。通過“ORF finder”分析，結果包括1個792 bp的開放閱讀框，81 bp的5′UTR和175 bp的3′UTR，編碼具有263個氨基酸的蛋白質(圖1)。將本研究獲得的羊草14-3-3蛋白序列與其他物種同源基因進行同源性分析，結果表明，羊草14-3-3蛋白與小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)和狗尾草(Setariaitalica)相似性分別為98%、94%、94%、94%，和岷江百合(Liliumregale)、龍眼(Dimocarpuslongan)、矮牽牛(Petuniaxhybrida)等相似度也達到80%以上。通過BLASTP進行檢索分析，結果表明羊草14-3-3蛋白和已知的14-3-3具有高度的同源性，例如與小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)節節麥(Aegilopstauschii)14-3-3s蛋白的相似性分別達到99%、98%、98%。通過Prosite對氨基酸序列保守結構域進一步預測，發現存在[RA]-N-L-[LIV]-S-[VG]-[GA]-Y-[KN]-N-[IVA]和Y-K-[DE]-[SG]-T-L-I-[IML]-Q-L-[LF]-[RHC]-D-N-[LF]-T-[LS]-W-[TANS]-[SAD]2個14-3-3蛋白的特征結構，進一步確認該蛋白屬于14-3-3蛋白家族。

圖1 羊草14-3-3的全長cDNA序列以及編碼的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Leymus chinensis14-3-3 protein

2.2 生物信息分析

根據羊草 14-3-3基因序列，在NCBI BLAST中選取10個物種，分別為小麥(Triticumaestivum)AEQ53933.1、玉米(Zeamays)ACG37368.1、岷江百合(Liliumregale)AGZ13503.1、矮牽牛(Petunia×hybrida) AGJ98232.1、棉花(Gossypiumhirsutum)NP_001314534.1 、龍眼(Dimocarpuslongan)ACK76233.1 、高梁(Sorghumbicolor)KXG25190.1、狗尾草(Setariaitalica)XP_004968972.1、楊樹(Populustremula×Populusalba)AAF76226.1、蕪菁(Brassicarapa)XP_009147332.1。通過DNAMAN對這10個物種基因序列和羊草 14-3-3基因序列進行多序列比對，比對結果如圖2所示。羊草14-3-3和其他物種14-3-3在α螺旋區域高度保守。通過http://web.expasy.org/protparam/，分析羊草14-3-3蛋白的理化性質,結果表明該蛋白的相對分子質量為29 887.61，等電點是4.62。該蛋白質的不穩定指數估算到52.38，屬于不穩定蛋白,在羊草14-3-3蛋白中約含49.05%的α螺旋，7.98%的延伸鏈，42.97%的不規則卷曲。通過http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html對羊草的三級結構進行預測，結果如圖3。

為了進一步確定羊草14-3-3在進化中的地位，通過DNAMAN構建系統進化樹，結果如圖4所示。從圖4中可以看出，所有14-3-3聚為3大支，其中羊草14-3-3蛋白和小麥14-3-3蛋白的親緣關系最近，單獨聚為一支，相似性達到98%，其次是玉米、高粱和狗尾草，相似性都達到了94%。系統進化樹的分析結果也有力的證明了同源分析的結果。

圖2 羊草14-3-3與其他植物14-3-3蛋白的多重序列Fig.2 Multiple alignment of Leymus chinensisand 14-3-3 protein of other species

圖3 羊草14-3-3蛋白的三級結構預測Fig.3 Leymus chinensis14-3-3 proteintertiary structure prediction

2.3 羊草 14-3-3基因在根、葉以及不同脅迫處理下的表達分析

RT-PCR分析表明， 14-3-3基因在羊草的葉片中的表達量比根部高。進行NaCl、Na2CO3和PEG 6000的脅迫處理，分別取0、6、12和24 h處理后的材料進行RT-PCR，結果如圖5所示。在NaCl、Na2CO3和PEG 6000脅迫下羊草中 14-3-3基因的表達量并未發生明顯變化，表達始終穩定，表明羊草14-3-3蛋白含量不受NaCl、Na2CO3和PEG 6000脅迫的影響。

3 討論與結論

本研究對羊草 14-3-3進行鑒定和功能分析。通過14-3-3蛋白的EST序列，使用RACE技術克隆得到14-3-3蛋白的全長序列，在NCBI BLAST中進行比對，找到10個同源序列，通過多序列比對，得到羊草14-3-3蛋白與其他物種在N端和C端具有較大差異。研究表明C端差異影響14-3-3蛋白與靶位點間的相互作用，可能與14-3-3蛋白的功能特異性有關[17]。另有研究表明，14-3-3蛋白N端與二聚體形成有關[18]。鑒于該研究結果，可為后續羊草中14-3-3蛋白作用機制的研究提供參考。

14-3-3蛋白作為調控蛋白在細胞的生命活動中扮演著無處不在的調節者，在許多植物的生物與非生物脅迫中起著重要的調控作用。為探索14-3-3蛋白對羊草抗逆性的影響，本研究分析羊草14-3-3蛋白在脅迫下的表達量。RT-PCR結果顯示，在NaCl、Na2CO3和PEG 6000脅迫下，羊草葉片中14-3-3蛋白的基因表達量并無明顯的變化，而未脅迫處理的羊草葉片中的表達量要遠高于根中。前人通過RT-PCR研究也發現，在正常培養條件下，番茄的幼根中12個不同的 14-3-3基因表達量有所不同,其中 TFT1、 TFT5和 TFT10表達量高， TFT4、 TFT6和 TFT7表達量穩定適中，而 TFT2、 TFT3、 TFT9和 TFT11表達量很低； TFT1、 TFT4、 TFT10和 TFT7在鹽脅迫下基因含量有提高，而大多是 14-3-3基因家族成員的表達量在鹽脅迫下并沒有 明顯的改變[20]。Zhao等[21]研究發現在植物中14-3-3 蛋白和ADF1相互作用調節肌動蛋白的穩定性[21]，推測羊草14-3-3蛋白可能與其他蛋白形成復合物在脅迫中起調控作用。本研究通過對羊草中 14-3-3基因的克隆、生物信息學分析以及組織和脅迫下表達量的分析，為14-3-3蛋白的功能探索奠定了理論基礎。

圖4 羊草14-3-3與其他物種14-3-3蛋白的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of complete amino acid sequences of Leymuschinensis 14-3-3 and 14-3-3 protein of other species

A.羊草葉片和根的RT-PCR分析結果 RT-PCR analysis results ofLeymuschinensisleaf and root ；B.羊草葉片在NaCl Na2CO3和PEG脅迫下0、6、12和24 h的RT-PCR分析結果 NaCl, Na2CO3and PEG 0 h, 6 h, 12 h and 24 h RT-PCR analysis results ofLeymuschinensisunder stress

圖5RT-PCR分析14-3-3在羊草中的表達特性
Fig.5Analysisoftheexpressionof14-3-3geneinLeymuschinensis

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