氯化鐵結合凝血酶構建兔靜脈竇血栓模型

魏 瑩， 管 生， 郭新賓， 鄧 鑫， 王子博， 李冬冬， 逯笑柯， 董艷華

顱內靜脈竇血栓形成（CVST）是由多種病因引起的腦靜脈回流受阻、常伴有腦脊液吸收障礙所致顱內高壓為特征的缺血性腦血管病［1-2］，占所有腦缺血病0.5%～1%，在口服避孕藥和圍產期女性中占比較高，是中青年缺血性腦血管病常見原因［3-5］。60%患者病變累及多個靜脈竇，以上矢狀竇（superior sagittal sinus，SSS）發病最為常見［5-7］。 發病原因與感染、妊娠、產褥期、口服避孕藥、惡性腫瘤及自身免疫性疾病等因素相關［1，3，8］，主要臨床表現為顱內壓增高引起頭痛、視神經乳頭水腫、嘔吐及靜脈梗死，或出血性腦損害引起大腦皮質局灶性受損癥狀，如中樞性運動障礙、失語等［1，4，9］。 由于病因復雜、發病隱匿及臨床表現多樣，誤診率及死亡率較高［1，3-4］。 近年對CVST病理生理學認識及診治有了長足進步，重要原因是動物模型構建方法如結扎法［10-12］，單純注入促凝物質［13-14］，局部貼敷氯化鐵［15-17］，血管介入［18-20］及光化學誘導［21-22］等不斷完善。 但這些方法仍存在結扎SSS誘導永久性血栓不能用于靜脈竇自身研究和治療效果評估［21，23-24］，單純注入促凝物質可隨血流進入其它血管或器官引起多臟器衰竭［19，21］，血管介入操作復雜及需要神經介入專業技術等問題，使其應用受限［18-19］；光化學照射易引起周圍小動脈血栓形成，影響實驗結果［24］。雖然局部應用40%氯化鐵建模方法操作簡單、創傷小及形成血栓可逆，但所誘導的血栓術后再通率較高，且血栓未延伸至皮層靜脈，使得慢性靜脈竇血栓及損傷腦實質病理生理研究受限［15-16，23-24］。 本研究在兔 SSS 貼敷40%氯化鐵模型基礎上，通過注入凝血酶誘導SSS-皮層靜脈血栓形成，旨在構建符合臨床病理生理和疾病進展的CVST動物模型，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

取新西蘭大白兔39只（鄭州大學動物實驗中心），雌雄不限，體重（2.5±0.5）kg。其它器材包括麻醉藥陸眠寧（吉林華牧動物保健品公司）、氯化鐵（天津致遠化學試劑公司）、白眉蛇毒凝血酶（中國華蘭生物工程公司）、碘普羅胺-300（德國Bayer公司）、DSA 儀（美國 GE 公司）、4 F動脈鞘、0.035英寸泥鰍導絲（日本Terumo公司）、4 F單彎造影管（美國Cordis公司）、Echelon-10微導管（美國 Micro Therapeutic公司）、Traxcess 14導絲（美國 micro Vention 公司）、2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京索萊寶科技公司）。

1.2 動物準備

實驗兔39只隨機分成A組、B組、C組，每組13只。A組：SSS局部貼敷0.9%氯化鈉溶液棉片10 min；B組：局部貼敷40%氯化鐵棉片10 min；C組：局部貼敷40%氯化鐵棉片5min并注入凝血酶。所有動物術后即刻作全腦血管DSA檢查，判斷SSS是否有血栓形成，術后2 d每組隨機抽取3只兔斷頭取腦作TTC染色，術后7 d每組剩余兔復查DSA并作蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.3 CVST動物模型制作

兔臀部肌內注射陸眠寧（0.1ml/kg）實施全身麻醉，俯臥位固定于立體定位架上，用恒溫控制加熱墊維持肛溫在38℃，保持呼吸道通暢；于顱頂正中作一縱形直切口（長約3 cm，前達額骨后至頂間骨前緣），液冷式鉆頭在冠狀縫后、人字縫間一側頂骨鉆孔，將其擴大成2.0 cm×1.2 cm大小骨窗；術中仔細操作，保持硬腦膜及靜脈竇完整，充分顯露SSS；剪取2.0 cm×0.2 cm無菌外科棉片備用，A組局部貼敷0.9%氯化鈉溶液棉片10 min，B組將棉片蘸取40%氯化鐵溶液，黑暗環境下貼敷至SSS表面10min，移除棉片并用0.9%氯化鈉溶液沖洗，C組黑暗環境下SSS局部貼敷40%氯化鐵棉片5 min后，用微量注射器穿刺SSS并緩慢注射凝血酶（100 U，1 000 U/ml），拔出注射器用無菌棉球壓迫止血，后逐層縫合傷口。

1.4 DSA造影

所有動物術后即刻行DSA判斷是否有血栓形成：全身麻醉仰臥位固定，8%硫化鈉腹股溝區脫毛，于股動脈搏動明顯處用1%利多卡因作局部麻醉并切開3 cm皮膚切口，分離股動脈；動脈下留置3-0纖維縫合線2根，分置于動脈遠近端備用；股動脈穿刺并置入4 F動脈鞘，注入肝素鈉（400 U/kg）全身肝素化；泥鰍導絲導引下4 F單彎造影管由股動脈送至主動脈弓，然后以4 F單彎造影管為導引導管，路圖導引下微導管在微導絲配合下完成選擇性和超選擇性造影（碘普羅胺-300與0.9%氯化鈉溶液按1∶1比例混合，1ml/次，注射時間2 s內，曝光次數4幀/s，造影持續時間10 s），觀察SSS血流是否通暢，造影畢拔出動脈鞘并于股動脈穿刺點遠近端用絲線結扎。建模術后7 d，每組10只兔復查DSA，并與之前DSA結果作對比，觀察靜脈竇有無再通，計算再通率。

1.5 TTC染色

每組于建模術后2 d，隨機抽取3只兔深度麻醉后立即斷頭取腦，將腦組織均勻切成厚2mm薄片，迅速放置在質量分數為2%TTC染液中，避光、37℃染色20 min后，觀察各組腦片顏色（紅色為正常組織，蒼白色為梗死灶）。

1.6 HE染色

末次DSA結束后麻醉兔，開胸推注200m l0.9%氯化鈉溶液，繼續滴注4%多聚甲醛固定液200ml（0.2 ml/L磷酸緩沖液，pH 7.3）；斷頭取硬腦膜及腦組織并將其置入4%多聚甲醛中固定，常規脫水、石蠟包埋、HE染色；光學顯微鏡下觀察SSS腦實質組織學改變。

1.7 統計分析

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。分類變量組間率比較用Fisher確切概率檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔CVST模型建立

建模術中所有兔耐受良好，觀察期內無死亡。對比手術前后各組SSS變化，A組SSS術前與術后相比無明顯變化，B組、C組術后SSS內均有黑色血栓形成（圖 1）。

2.2 DSA評估

建模術后即刻DSA顯示，A組兔SSS內血流通暢，無血栓形成，B組、C組SSS內均有血栓形成，表現為SSS局部血流中斷；術后7 d每組10只兔復查DSA顯示，A組SSS血流通暢無變化，B組血栓再通率為 70%（7/10），C 組再通率為 10%（1/10），明顯低于 B 組（P＝0.02）（圖 2）；由此可知，單用氯化鐵和氯化鐵結合凝血酶兩種模型制作方法，均可造成SSS內血栓形成，但氯化鐵結合凝血酶較單用氯化鐵誘導的血栓更加穩定。

2.3 TTC染色

建模術后2 d TTC染色顯示，B組、C組兔SSS周圍腦實質內均可見蒼白色缺血灶（圖3），提示縮短貼敷氯化鐵時間結合凝血酶注入誘導的兔模型，同樣可誘導SSS周圍腦組織梗死。

圖3 TTC染色結果

2.4 HE染色

與A組相比，B組HE染色顯示SSS管腔內血栓形成，竇壁上有明顯氯化鐵沉積，皮層下腦實質內可見炎性細胞聚集及輕度腦水腫等病理改變，C組除可誘導出SSS血栓，同時伴有皮層靜脈血栓形成及皮層下大量紅細胞聚集（圖4）；提示與單用氯化鐵相比，氯化鐵結合凝血酶不僅可更多地模擬CVST病理改變，而且對腦組織損傷較小。

3 討論

CVST是一種特殊類型缺血性腦血管病，特點為發病急、進展快、臨床表現復雜，誤診率及漏診率極高，是中青年缺血性腦血管病常見原因［2，5，8，25］。 該病確切發病機制及病理生理過程尚未完全闡明，目前公認靜脈血栓形成的主要因素為靜脈血液淤滯、靜脈內皮損傷、局部或全身血液高凝狀態［26］。與臨床疾病發病機制相似的動物模型有助于縮短研究時間，在人為控制影響因素條件下進行特定方面研究，并為疾病發病機制及其診斷、治療研究提供可靠基礎。

圖4 3組HE染色圖像

理想的CVST動物模型需具備以下特征：①所表現的病理生理過程與臨床相似；②血栓組成和病理過程與人類疾病相似；③可用于評估不同治療方法和效果［21，24］。 目前的動物模型類型主要有鼠、兔、貓、豬等。新西蘭大白兔易飼養，顱腦大小適中，便于進行多項生化指標觀察，同時其SSS管腔相對較大，可予以后續血管腔內介入治療操作，且腦血管接近人腦血管，適合靜脈閉塞后病理學和影像學研究［27］。

Kurz等［28］1990年報道通過局部血管貼敷氯化鐵模擬內皮細胞損傷，觸發血小板黏附和暴露膠原纖維并成功構建兔腦動脈血栓形成模型。之后Rottger等［15］、Srivastava 等［17］分別采用此方法首次構建成可逆性SSS血栓形成動物模型，所誘導的內皮損傷機制與臨床相似，形成血栓可逆，故可用于血栓自發性再通、腦組織損傷分子機制研究及評估各種治療效果，是國內外應用范圍最廣的動物模型。然而單純貼敷氯化鐵術后血栓再通率較高，術后1 d再通率達50%，且臨床研究表明CVST自出現癥狀至作出診斷的時間有不同延遲（一般為7 d），模擬臨床癥狀需要誘導的血栓相對穩定，同時誘導的血栓僅局限于SSS，皮層靜脈無血栓形成，因此該模型不能完全模擬CVST病理損傷及慢性過程病理改變［15，17，23-24］。 凝血酶局部注入，可通過血流進入靜脈竇和皮層靜脈中激活血小板，催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，造成局部血液高凝狀態，誘導血栓形成，但單純持續注入凝血酶初期SSS血流通暢，誘導血栓形成部位不固定且凝血酶易隨血流進入遠端，可引起肺栓塞甚至多臟器衰竭，因此國內外學者首先通過結扎或光化學照射等方法阻塞或減慢SSS局部血液流速，進而結合凝血酶注入誘導穩定血栓［12，17，21］。

為了構建與臨床疾病發病機制和病理過程更為相似的CVST動物模型，首先應通過局部貼敷40%氯化鐵棉片誘導不穩定血栓，隨后注入凝血酶致使局部血液高凝狀態，從而成功建立靜脈竇血栓形成模型。由于兔顱腦靜脈竇管徑較大鼠大，血流較快，單純貼敷氯化鐵5min未成功誘導血栓形成，因此通過延長氯化鐵貼敷時間模擬傳統SSS單純貼敷氯化鐵誘導血栓兔模型并與之對比；術后即刻及術后7 d DSA檢查發現，貼敷氯化鐵并注入凝血酶動物模型可成功誘導SSS及皮層靜脈血栓形成，同時血栓更加穩定，術后7 d血栓再通率明顯降低，可有效地用于觀察慢性靜脈竇血栓病理改變及評估藥物溶栓等治療效果；術后組織學分析進一步證實，氯化鐵結合凝血酶構建的動物模型在降低氯化鐵貼敷時間的同時，不僅可模擬傳統模型SSS周圍腦組織梗死及細胞水腫等病理改變，還可模擬皮層血栓導致的淤點性出血，因此較傳統模型更接近臨床靜脈竇血栓的病理改變。

綜上所述，采用SSS局部貼敷氯化鐵并注入凝血酶方法可構建穩定的兔靜脈竇血栓形成模型。該模型與傳統模型相比，可更好地模擬臨床疾病發病機制，形成的血栓穩定，與臨床CVST病理生理學改變相似，因此可更好地用于CVST基礎研究及評估各種治療效果，從而為疾病發生發展及預后提供研究基礎。

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