雷替曲塞經(jīng)不同給藥方式的藥動(dòng)學(xué)分析

黃巧勝， 陳少鋒， 鐘澤龍， 王衛(wèi)東， 張 濤， 余曉霞， 李國(guó)成， 伍俊妍， 許林鋒

雷替曲塞為抗代謝類葉酸類似物，是一種胸苷酸合成酶（TS）抑制劑［1］。TS是胸腺嘧啶脫氧核苷三磷酸鹽（TTP）合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，而TTP是DNA合成的必需核苷酸。因此通過(guò)抑制TS可導(dǎo)致DNA斷裂和細(xì)胞凋亡。雷替曲塞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，很快代謝成一系列對(duì)TS抑制作用更強(qiáng)的多聚谷氨酸鹽貯存在細(xì)胞內(nèi)，而且其在細(xì)胞內(nèi)潴留的時(shí)間更長(zhǎng)，從而更有效抑制細(xì)胞DNA的合成，更加持續(xù)地發(fā)揮抗腫瘤作用。

張?chǎng)蔚龋?］通過(guò)小豬模型研究了雷替曲塞動(dòng)脈持續(xù)灌注化療期間在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，基于以上的研究基礎(chǔ)及臨床現(xiàn)狀，本研究通過(guò)建立兔肝VX2腫瘤模型，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法［3］，檢測(cè)經(jīng)股靜脈灌注、肝動(dòng)脈灌注、肝動(dòng)脈碘油混懸液注入、肝動(dòng)脈灌注后明膠海綿栓塞給藥后5、10、15、30、45min 和 1、3、6、12、24 h 股靜脈血中藥物濃度，考察雷替曲塞不同給藥方式藥動(dòng)學(xué)特征，補(bǔ)充雷替曲塞用于肝動(dòng)脈灌注栓塞治療原發(fā)性肝癌的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，為臨床試驗(yàn)的開展和臨床推廣提供更多的基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及瘤株 新西蘭大白兔40只，雌雄各半，3～5月齡，體重 2.0～2.5 kg（由廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供）。VX2荷瘤種兔由華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品和試劑 雷替曲塞對(duì)照品（純度為99.7%，由南京正大天晴制藥有限公司提供）；內(nèi)標(biāo)物為氟康唑?qū)φ掌罚兌?9.8%，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號(hào)100314-201204）；試驗(yàn)用水為重蒸去離子水；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純。

1.1.3 儀器 Aglitent 1200高效液相色譜法儀，Aglient 6420 triple quad LC/MS，Agilent色譜化學(xué)工作站，Milli-Q Gradient A10超純水器（Millipore Inc.USA），XS25DU 電子天平（瑞士 METTLER TOLEDO），XW-80A渦旋混合器（原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），Centrifuge 5424高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendrof）。

1.2 方法

1.2.1 兔VX2肝腫瘤模型建立 兔肝VX2腫瘤模型是非常成熟的動(dòng)物模型，具有接種簡(jiǎn)單、成功率高的特點(diǎn)，容易制成原位腫瘤動(dòng)物模型，同時(shí)兔肝VX2腫瘤為目前國(guó)內(nèi)做大動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)性肝癌模型，其供血?jiǎng)用}主要為肝動(dòng)脈的富血管性的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的實(shí)體腫瘤。具體過(guò)程：①切取種植于種兔大腿內(nèi)側(cè)的VX2生長(zhǎng)旺盛的呈魚肉樣的腫瘤組織塊，剪成2～3mm的組織小塊，浸泡在加有慶大霉素的4℃0.9%NaCl溶液保存?zhèn)溆谩＂谟?0%水合氯醛按2.5ml/kg腹腔注射進(jìn)行全身麻醉，將兔子仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，予上腹部備皮，清潔后用安爾碘Ⅲ型皮膚消毒液進(jìn)行消毒2次，范圍約15 cm，鋪上無(wú)菌洞巾。于劍突下正中間約1 cm處皮下注射2%利多卡因進(jìn)行局部麻醉，在局麻處沿腹白線作一長(zhǎng)約3 cm正中切口，依次分離皮膚、筋膜、肌肉、腹膜，撐開切口，用無(wú)菌棉簽小心夾取暴露肝左葉，再用潤(rùn)濕紗布包裹肝臟小心牽拉出腹腔，用眼科鑷刺破肝包膜，形成一竇道，接著夾取0.9%NaCl溶液中備好的 VX2腫瘤組織塊植入竇道內(nèi)，最后夾取明膠海綿條塞入竇道口止血，回納肝臟，確保內(nèi)臟恢復(fù)解剖關(guān)系后，逐層縫合腹壁，術(shù)后當(dāng)日慶大霉素1萬(wàn)U腹腔注射，每天1次給予肌內(nèi)注射芐星青霉素6萬(wàn)IU/kg，連續(xù)3 d。2周后應(yīng)用MRI檢查或開腹直視下對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行成瘤成功判定并評(píng)定腫瘤大小和位置。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 40只肝VX2腫瘤模型兔隨機(jī)分為A，B，C，D，4組，每組10只。A組為雷替曲塞股靜脈灌注組，經(jīng)股靜脈留置針灌注藥物，維持給藥時(shí)間為15 min，B組為雷替曲塞肝動(dòng)脈灌注組，C組為雷替曲塞肝動(dòng)脈碘油混懸液注入組，D組為雷替曲塞肝動(dòng)脈灌注后明膠海綿栓塞組。B，C，D組實(shí)驗(yàn)兔均在DSA造影機(jī)引導(dǎo)下，經(jīng)股動(dòng)脈引入微導(dǎo)管至肝固有動(dòng)脈，然后經(jīng)微導(dǎo)管注入藥物，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的等效劑量比值折算［3］，每只實(shí)驗(yàn)兔注入藥物總量為0.50 mg，維持每次給藥時(shí)間為15 min。

1.2.3 標(biāo)本采集方法 A、B、C、D 4組動(dòng)物分別于給藥后 5、10、15、30、45 min 和 1、3、6、12、24 h 通過(guò)股靜脈留置針于股靜脈采血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血1ml，置于肝素化試管中，離心收集上層血漿置于EP管中，-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.4 雷替曲塞血漿藥物濃度檢測(cè)方法建立

1.2.4.1 分析條件：色譜柱為Agilent Zorbax SBC18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水（含0.1%甲酸）（20 ∶80，V ∶V）；流速：0.2m l/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量為2μl。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），正離子化，掃描方式為選擇性離子監(jiān)測(cè)，雷替曲塞（m/z 459.1→173.1）和氟康唑（m/z 307.1→238.3），毛細(xì)管電壓 4 000 V，噴霧氣壓力 40 PSI，干燥氣體流速10 L/min，干燥氣體溫度350℃，雷替曲塞和氟康唑的碰撞能量分別為42ev，14ev，裂解電壓分別為105 V，110 V，電子倍增器200 V。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別精密稱取雷替曲塞、氟康唑?qū)φ掌愤m量（分別含雷替曲塞、氟康唑各10 mg），分別置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，即配制成濃度為0.2mg/ml的貯備液。將雷替曲塞儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成40、200、1 000、2 000、10 000、20 000 和 40 000 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。另稀釋配置濃度為2 000 ng/ml的內(nèi)標(biāo)氟康唑甲醇溶液。

1.2.4.3 血漿樣品處理方法：精密吸取家兔血漿200μl于EP管中，加入內(nèi)標(biāo)（2 000 ng/ml氟康唑甲醇溶液）10 μl，振蕩混勻，加入甲醇 800 μl，渦旋振蕩1min后，于15 000 r/min離心 10min，吸取上清液置另一EP管中，42℃真空干燥至干，進(jìn)樣前加入甲醇100μl，渦旋30 s使殘?jiān)芙猓?5 000 r/min離心10min，吸取上清液2μl進(jìn)樣。

圖1 測(cè)定血漿中雷替曲塞和氟康唑的MRM色譜圖

1.2.4.4 方法專屬性：取6份不同來(lái)源的空白血漿各100μl，在“1.2.4.3血漿樣品處理方法”項(xiàng)依法操作，獲得空白血漿樣品的色譜圖，如圖1①；將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，依同法操作獲得相應(yīng)的色譜圖，如圖1②，雷替曲塞、氟康唑的保留時(shí)間分別約為3.0、6.3min；取家兔注射雷替曲塞后收集的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1③④。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾雷替曲塞及內(nèi)標(biāo)氟康唑的測(cè)定。

1.2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限：取雷替曲塞對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入空白家兔血漿，稀釋成2，10，50，100，200，1 000，2 000 ng/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按“2.5血漿樣品處理”項(xiàng)處理后進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定。以血漿中雷替曲塞濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比為橫坐標(biāo)（X），藥物峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），權(quán)重系數(shù)為1/χ2，最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得直線回歸方程即為血漿中雷替曲塞，定量下限為2 ng/ml（S/N＞5）。雷替曲塞在2～2 000 ng/ml范圍內(nèi)線性良好（r＞0.99），典型代表方程為：Y＝0.500844X＋0.005816。配制6份2 ng/ml的血漿樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法分別處理測(cè)定，測(cè)得結(jié)果的RSD＜15%。

1.2.4.6 方法精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率：低（10 ng/ml）、中（100 ng/ml）、高（1 000 ng/ml）濃度的質(zhì)控樣品，各5份，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品濃度，計(jì)算樣品結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度。另取空白血漿，除不加雷替曲塞溶液和內(nèi)標(biāo)外，按“1.2.4.3”項(xiàng)方法操作。取上清液稀釋雷替曲塞和內(nèi)標(biāo)至相應(yīng)濃度，進(jìn)樣分析。以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。精密度和提取回收率結(jié)果見表1。

表1 雷替曲塞精密度、準(zhǔn)確度及提取回收率

1.2.4.7 基質(zhì)效應(yīng)考察及穩(wěn)定性考察：取18管空白血漿各200μl平分為三組，每組6管，加入甲醇800μl，渦旋振蕩 1min后，于15 000 r/min離心10 min，吸取上清液置另一EP管中，42℃真空干燥至干。 殘?jiān)屑尤氲停?00 ng/ml）、中（2 000 ng/ml）、高（20 000 ng/ml）的雷替曲塞和氟康唑（2 000 ng/ml）各 10 μl，加入甲醇 80 μl，渦旋 30 s，于 15 000 r/min離心 10 min；另取18管EP管平分為3組，每組6管，殘?jiān)屑尤氲停?00 ng/ml）、中（2 000 ng/ml）、高（20 000 ng/ml）的雷替曲塞和氟康唑（2 000 ng/m l）各 10 μl，另加入甲醇 80 μl，渦旋 30 s，于 15 000 r·min離心10min。2種方法測(cè)得的雷替曲塞峰面積的比值計(jì)算基質(zhì)因子，并除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。結(jié)果6批基質(zhì)計(jì)算的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子變異系數(shù)為14.2%，小于15%。

取血漿樣品低（10 ng/ml）、中（100 ng/ml）、高（1 000 ng/ml）3種濃度分別在室溫放置24 h、凍融3次，結(jié)果表明樣品基本穩(wěn)定，RSD＜15%。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用DAS2.0軟件進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)分析。

2 結(jié)果

A、B、C、D 4 組給藥后，tmax均為 5 min；t1/2（h）分別為（5.88±1.39），（7.31±2.60），（9.86±5.10），（7.19±2.27），其中C組t1/2最長(zhǎng)，與A組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； Cmax分別為（2 056.40±139.17），（1 389.21±180.28），（911.84±105.62），（1 133.41±181.42） ng/ml·h，A 組 Cmax明顯高于 B， C， D 3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中C組最低；AUC0-t分別為（5482.72±1007.07），（4156.99±1475.77），（2 785.13±1 107.36），（3 903.64±947.25） ng/ml·h，A組AUC0-t明顯高于B，C，D 3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中C組最低。見表2。

表2 用DAS2.0軟件計(jì)算雷替曲塞在血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表2 用DAS2.0軟件計(jì)算雷替曲塞在血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注： 與 A 組比較 a P＜0.05，b P＜0.01，c P＞0.05

組別AUC0-t/（ng/m l·h） AUC0-∞/（ng/m l·h） C max/（ng/m l） t1/2/h A 5 482.72±1 007.07 5 507.38±1022.90 2 056.40±139.17 5.88±1.39 B 4 156.99±1 475.77a 4 213.34±1508.12a 1 389.21±180.28c 7.31±2.60 C 2 785.13±1 107.36b 2 868.56±1176.87b 911.84±105.62a 9.86±5.10 D 3 903.64±947.25b 3 956.80±994.10b 1 133.41±181.42c 7.19±2.27

3 討論

圖2 A、B、C、D 4組平均藥時(shí)曲線圖

原發(fā)性肝癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤，由于起病隱襲，早期診斷困難和進(jìn)展迅速，確診時(shí)大多數(shù)已達(dá)局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療棘手，生存期較短，預(yù)后極差。現(xiàn)階段主要的治療手段仍然是根治性切除手術(shù)［4］，但臨床上不少病例確診時(shí)已不適宜行手術(shù)切除術(shù)，手術(shù)切除率僅約為20%，另外肝癌手術(shù)切除后有較高的復(fù)發(fā)率，復(fù)發(fā)的患者中有很大一部分患者也無(wú)法再行手術(shù)切除。TACE已成為原發(fā)性肝癌及肝轉(zhuǎn)移的主要的治療方法之一［5-6］，已成為公認(rèn)的不能手術(shù)切除原發(fā)性肝癌的首選，而且在能切除的肝癌、有癌栓的肝癌及肝臟轉(zhuǎn)移癌的治療中也得到了應(yīng)用，安全可靠。目前常用的化療藥物有5-FU、雷替曲塞、阿霉素、表阿霉素、絲裂霉素、羥基喜樹堿、鉑類藥物等［7］，但目前國(guó)內(nèi)闡述經(jīng)肝動(dòng)脈灌注/灌注栓塞的藥動(dòng)學(xué)的研究比較少。

不同給藥方式，藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程不一樣，經(jīng)動(dòng)脈給藥后，藥物首先由血漿分布至靶組織，然后進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，再分布到其他組織中去［8］，而靜脈注射后，藥物首先經(jīng)過(guò)系統(tǒng)循環(huán)，再分布至靶組織。

化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的最大殺傷效果主要取決于局部組織藥物的濃度（C）和藥物與腫瘤細(xì)胞的作用時(shí)間（T），即C×T值的大小，經(jīng)動(dòng)脈給藥可以使C×T 的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他給藥途徑［9］。

動(dòng)脈化療已在多種實(shí)體性腫瘤的治療中廣泛應(yīng)用［10-14］，因?yàn)槠溲獫{中的藥物峰濃度及AUC值相對(duì)較低，全身毒性相對(duì)較低，具有一定優(yōu)勢(shì)。Maurer等［9］的研究結(jié)果表明：動(dòng)脈區(qū)域灌注化療時(shí)腫瘤邊緣化療藥物濃度是全身化療時(shí)的9～68倍。高濃度、長(zhǎng)時(shí)間的抗癌藥物集中于癌腫組織中，必定會(huì)使大量腫瘤細(xì)胞受到抑制，療效得到提高。另一方面經(jīng)動(dòng)脈區(qū)域灌注給藥可減少抗癌藥物與血漿蛋白結(jié)合，局部游離藥物濃度明顯增加，從而使抗癌藥物的療效得到提高。

研究表明雷替曲塞的抗癌效果不僅僅來(lái)源于藥物本身，給藥后48 h內(nèi)只有55%的雷替曲塞以藥物原型被排泄，一部分藥物通過(guò)還原型葉酸甲氨蝶呤細(xì)胞膜被細(xì)胞主動(dòng)攝取，從而被葉酸聚谷氨酸合成酶代謝成一系列多聚谷氨酸類化合物，此類化合物對(duì)胸苷酸合酶有著更強(qiáng)的抑制作用，且能長(zhǎng)時(shí)間潴留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮長(zhǎng)期毒性［15-16］。

張?chǎng)蔚龋?］的研究中，發(fā)現(xiàn)雷替曲塞動(dòng)脈持續(xù)灌注化療可以在足夠的時(shí)間內(nèi)保持局部組織內(nèi)較高血藥濃度，且外周血中濃度極低，有利于提高局部腫瘤藥物濃度直接殺死腫瘤細(xì)胞，降低全身不良反應(yīng)。

本研究通過(guò)兔肝VX2腫瘤模型，利用介入治療的技術(shù)經(jīng)股動(dòng)脈引入微導(dǎo)管至肝固有動(dòng)脈進(jìn)行動(dòng)脈灌注化療或肝動(dòng)脈化療栓塞，考察雷替曲塞經(jīng)股靜脈灌注、肝動(dòng)脈灌注、肝動(dòng)脈碘油混懸液注入、肝動(dòng)脈灌注后明膠海綿栓塞給藥的藥動(dòng)學(xué)情況。

研究結(jié)果顯示A，B，C，D 4組給藥后，A組其AUC0-t為（5 482.72±1 007.07）（ng/ml·h）明顯高于B，C，D 3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），是 C 組的1.97倍，D組的1.40倍，B組的1.32倍，這說(shuō)明經(jīng)動(dòng)脈給藥后，藥動(dòng)學(xué)發(fā)生了一定的變化，經(jīng)動(dòng)脈給藥后外周血漿中AUC值要明顯比靜脈給藥低，其中C組經(jīng)股動(dòng)脈碘油混懸液注入AUC值最低。這說(shuō)明經(jīng)動(dòng)脈給藥后，血漿中分布的藥物相對(duì)減少，可能有更多的藥物沉積到靶組織，其中C組經(jīng)動(dòng)脈碘油混懸液注入尤為明顯。實(shí)體腫瘤組織內(nèi)往往新生血管豐富，血流量大，碘化油與雷替曲塞混懸劑經(jīng)動(dòng)脈推注，大部分在虹吸作用下選擇性地流向腫瘤區(qū)［8］，并且能夠緩慢釋放，使得在一定時(shí)間范圍內(nèi)腫瘤局部藥物濃度升高，而血漿藥物濃度相對(duì)較低，且保留更長(zhǎng)的時(shí)間，因此經(jīng)肝動(dòng)脈碘油混懸液推注有可能增強(qiáng)化療療效的作用。B，C，D組給藥化療藥物在血漿中的峰濃度（Cmax）和藥時(shí)曲線下面積（AUC）均比A組小，C組t1/2為9.86 h，相對(duì)其他組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也說(shuō)明藥物的碘油混懸液沉積于腫瘤靶區(qū)后，有可能在局部維持高濃度的同時(shí)，緩慢釋放藥物，使腫瘤靶區(qū)有較長(zhǎng)的藥物接觸時(shí)間。因此C組經(jīng)動(dòng)脈碘油混懸液注入可能將對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮最大殺傷效果，還能最大限度降低全身不良反應(yīng)。

雷替曲塞經(jīng)肝動(dòng)脈給藥，首先接觸的靶器官是肝臟，然后進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)，再分布到其他組織中去，本研究結(jié)果顯示外周血漿AUC值及Cmax值均顯著小于靜脈組。這表明經(jīng)動(dòng)脈給藥增加腫瘤靶區(qū)藥物濃度的同時(shí)，對(duì)全身產(chǎn)生的毒副作用可能減小，提高患者耐受程度。血藥濃度并不是判定藥效的唯一標(biāo)準(zhǔn)，組織細(xì)胞內(nèi)濃度也是決定藥效的重要因素。雷替曲塞經(jīng)不同給藥方式后在肝組織中以及腫瘤組織分布情況，值得進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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