pH值對普魯蘭多糖發酵的影響及其機理分析

談夢飛，高謙，王建梓，喬長晟，，*

（1.天津科技大學工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.代謝控制發酵技術國家地方聯合實驗室，天津300457；3.天津科技大學生物工程學院，天津300457；4.天津科技大學食品工程與技術學院，天津 300457）

普魯蘭多糖是一種微生物胞外多糖，其化學結構是以麥芽三糖為單體聚合而成[1]，主要由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）發酵產生。麥芽三糖通過α-1，6糖苷鍵結合起來的高分子聚合物，其分子量（Mw）分布范圍廣泛，通常在 4.8×104Da～2.2×106Da，約480個麥芽三糖單體[1]，培養條件、培養基成分以及生產菌株變化的影響，聚合度大小隨之改變[2]。普魯蘭多糖因其具備無毒且生物安全的特性，被廣泛的應用于醫藥、食品、化妝品等領域[3]，其優良的理化性質決定了其具備廣闊的應用前景。

普魯蘭多糖合成途徑中的3種關鍵酶分別是α-磷酸葡萄糖變位酶（PGM），UDPG焦磷酸化酶（UGPase），磷酸葡萄糖基轉移酶[4]。Shingel報道稱尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是合成普魯蘭多糖必要的前體物[5]。UDPG是由PGM和UGPase催化轉化不同碳源所得的[6]。Catley等[7]提出了短梗霉多糖形成多糖的進程中，葡萄糖基轉移酶催化下UDPG中的葡萄糖殘基轉移，并與脂質分子連接形成普魯蘭多糖鏈。就目前研究來看[8-9]，出芽短梗霉以蔗糖為碳源發酵，普魯蘭多糖轉化率最高。因此推測普魯蘭多糖合成的可能途徑，如圖1所示。因此，PGM和UGPase的活性都對普魯蘭多糖合成起著至關重要的作用[10]，本文研究了不同pH值條件對普魯蘭多糖發酵的影響，并提出雙階段調控pH值來進一步提高普魯蘭多糖產量的方法，同時以UDPG含量及PGM和UGPase活性的變化來分析普魯蘭多糖合成機理。

圖1 普魯蘭多糖合成大致代謝流程Fig.1 proposed pathway of pullulan synthesis in A.pullulans

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）：保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。保藏號：CGMCCNO.7055。

1.1.2 主要儀器設備

08-F25型5 L自動發酵罐：鎮江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A型高速離心機：上海安亭科學儀器廠；Agilent 1200液相色譜分析儀：美國安捷倫公司；Infinite ?200 Pro NanoQuant酶標儀：瑞士Tecan公司。

1.1.3 培養基

種子培養基（g/L）：蔗糖100、酵母浸粉3、（NH4）2SO41、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.4、NaCl 2.5、FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，121 ℃滅菌 20 min。

發酵培養基（g/L）：蔗糖 150、蛋白胨 5、K2HPO47、MgSO4·7H2O 0.4、NaCl 3、FeSO4·7H2O 0.05，按0.0001%量添加泡敵（植物油），121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 分批發酵培養方法

在培養好的斜面上挑取一環孢子接入裝液量為100 mL的500 mL擋板瓶中，28℃，180 r/min搖床恒溫培養28 h～32 h，制得種子液。將種子液以3%的接種量接入裝液量為3 L的5 L發酵罐中，通風比為1：1.25，發酵前24 h溫度維持在32℃，24 h后溫度調節到28℃，罐壓恒定在0.02 MPa，初始pH6.0，轉速：400 r/min。

1.2.2 發酵試驗分析方法

1.2.2.1 多糖的測定[11-12]

將發酵液5 000 r/min離心20 min后，取30 mL上清液加入兩倍體積乙醇，攪拌均勻，靜置1 h后抽濾，所得多糖置于105℃干燥至恒重。

1.2.2.2 生物量的測定[13]

發酵液離心后，將上清液倒出，隨后用蒸餾水洗滌菌體2次～3次后，所得菌體于80℃烘箱至恒重，稱重。

1.2.3 無細胞提取液制備

量取15 mL發酵液，在4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，用冷凍0.9%NaCl溶液將菌體洗滌3次后，將菌體重懸于1.0 mL預冷的1 mol/L的Tris-HCl（pH7.6）緩沖液。使用超聲破碎儀破碎30 min后，在4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，去除細胞碎片。總蛋白含量以Bradford方法測定[14]。

1.2.4 尿苷二磷酸葡萄糖含量的測定[15]

利用安捷倫帶有紫外檢測器的高效液相色譜檢測尿苷二磷酸葡萄糖含量。液相條件：色譜柱：J&KCHEICA HPLC column C18（5 μm，250 mm ×4.6 mm i.d.），流動相：pH6.0的40 mmol/L三乙銨醋酸鹽緩沖溶液，柱溫：22 ℃，流速：1 mL/min，進樣量：10 μL。

1.2.5 磷酸葡萄糖變位酶酶活的測定（PGM）

在翟自立[16]等的方法上進行改進。反應混合物 60 mmol/L Tris-HCl（pH7.0），7 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L NADP，5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L 葡萄糖-1，6-二磷酸，2U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和30μL適量稀釋的無細胞提取液，反應2 min，加入0.1 mmol/L葡萄糖-1-磷酸至終體積250 μL。在340 nm下測定光密度，一個酶活力單位定義為：每分鐘轉化1 μmol底物的酶量所需酶量。

1.2.6 UDPG焦磷酸化酶酶活的測定（UGPase）

在Duan等[4]的方法上進行改進。反應混合物包括 60 mmol/L Tris-HCl（pH7.0），8 mmol/L MgCl2，1 mmol/L UDPG，2.1 U磷酸葡萄糖變位酶（PGM），4 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH），0.4 mmol/L NADP+，4 mmol/L無機磷酸鹽和30 μL適量稀釋的無細胞提取液至終體積250 μL。在30℃條件下開始反應。在340 nm下測定吸光值。一個酶活力單位定義為：每分鐘轉化1 μmol底物的酶量所需酶量。

1.3 統計分析

每個試驗處理獨立重復3次，采用Microsoft Excel 2007、origin8.5統計軟件對所有數據進行數據處理和顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 不同初始pH值對普魯蘭多糖發酵的影響

利用 500 mL 擋板瓶對初始 pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5條件下發酵普魯蘭多糖進行研究，結果如表1所示。

表1 不同初始pH值對普魯蘭多糖發酵的影響Table 1 Effect of initial pH on pullulan fermentation

根據表1可以看出，在初始pH 6.0條件下，普魯蘭多糖的產量最高達到（63.75±0.09）g/L，同時生物量達到（9.23±0.31）g/L。初始pH值調至7.5時普魯蘭多糖產量和生物量均最低，發現普魯蘭多糖產量隨初始pH值降低而逐漸增高，由此可推斷出芽短梗霉在偏弱酸性環境下更利于合成普魯蘭多糖。而初始pH5.5時普魯蘭多糖產量又低于初始pH6.0，故普魯蘭多糖發酵初始pH值過低不利于多糖合成。因此，選擇初始pH6.0作為普魯蘭多糖發酵初始pH值條件。

隨后，對初始pH6.0條件下發酵普魯蘭多糖進行5 L罐驗證試驗，各發酵參數的變化趨勢如圖2所示。

圖2 初始pH6.0對普魯蘭多糖發酵的影響Fig.2 Effect on fermenting pullulan under condition of initial pH6.0

由圖2可以看出在發酵32 h～64 h大量合成普魯蘭多糖，而64 h后，普魯蘭多糖產量趨于穩定。生物量在24 h后進入穩定期，而64 h后再升高。不難推測，隨著多糖合成減慢甚至基本停滯，碳代謝向出芽短梗霉菌體合成方向轉移，導致生物量不斷升高。還可以看出隨普魯蘭多糖產量增加，由于有機酸合成加劇，發酵pH值也隨之逐漸下降。在64 h后pH值逐漸趨于平緩，而此時多糖合成量亦趨于停滯，可見當pH值降低至4.5以下甚至更低時，不利于普魯蘭多糖合成。因此，控制pH值發酵恒定在6.0、5.5、5.0研究普魯蘭多糖發酵的影響。

2.2 不同恒定pH值對普魯蘭多糖發酵的影響

不同恒定pH值對普魯蘭多糖發酵的影響見圖3。

圖3 不同恒定pH值對普魯蘭多糖發酵的影響Fig.3 Effect on biomass by fermented pullulan under different stable pH value

利用5 L發酵罐分別對恒定pH6.0、5.5、5.0對普魯蘭多糖發酵的影響進行研究，由圖3（A）可以看出維持發酵pH值恒定延長了出芽短梗霉對數生長期的時間，恒定pH值為6.0和5.5的兩試驗組在發酵48 h后，生物量高于初始pH6.0該空白組，同時進入穩定期，生物量分別為（10.24±0.33）g/L和（11.89±0.316）g/L，始終維持恒定pH值至6.0和5.5，雖然生物量高，但是菌體生長速率變低。而恒定pH5.0組不僅菌體生長緩慢，并且生物量一直處于較低水平，可見在普魯蘭多糖發酵開始階段，pH值偏低不利于菌體生長。另外，維持恒定pH6.0、5.5、5.0這3組的普魯蘭多糖產量始終低于初始pH6.0組，見圖3（B），并且根據pH值由高到低，終產量也呈由高到低的趨勢，終產量依此為（45.73±2.41）、（39.15±1.45）、（33.21±2.1）g/L。由此可見在發酵過程中pH值始終恒定于某一特定值對普魯蘭多糖發酵起到抑制作用，降低普魯蘭多糖產量。

2.3 不同雙階段控制pH值對普魯蘭多糖發酵的影響

由于始終將pH值控制恒定為某一特定值對普魯蘭多糖產量并無明顯提高。同時在監控初始pH6.0組發酵普魯蘭多糖過程中pH值的變化趨勢，可發現當發酵進行至對數生長期（即發酵24 h）后，普魯蘭多糖合成量急劇增加，此階段發酵pH值范圍在4.5到5.5范圍。因此對采用雙階段調控pH值方式發酵普魯蘭多糖進行研究。不同雙階段控制pH值下的普魯蘭多糖產量及生物量見表2。

表2 不同雙階段控制pH值下的普魯蘭多糖產量及生物量Table 2 pullulan and biomass under fermented condition of twophase controlling pH valve

以初始pH6.0為空白組，發現第二階段pH值控制在4.5組（即pH6.0～4.5組）的生物量在發酵結束時最高，達到（16.75±0.36）g/L，而第二階段控制在5.0，5.5（即 pH6.0～5.0組、pH6.0～5.5 組）的生物量亦高于空白組，可見在菌體生長進入穩定期后調節pH值維持恒定更利于菌體生長，并且pH值較低時菌體合成量越高。但從表2，可看出pH6.0～5.0試驗組的產量最高，較空白組高出22.5%，而pH6.0～4.5多糖產量不如pH6.0～5.0組，證明pH6.0～4.5組相較于pH6.0～5.0組更適于菌體合成，而菌體合成普魯蘭多糖的能力弱于pH6.0～5.0組。

2.4 不同pH值條件對磷酸葡萄糖變位酶（PGM）和UDPG焦磷酸化酶（UGPase）活性的影響

pH值對UDPG焦磷酸化和磷酸葡萄糖變位酶酶活性的影響見圖4。

UDPG焦磷酸化酶（UGPase）是催化葡萄糖-1-磷酸與UTP生成普魯蘭多糖合成重要前體尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）的關鍵酶（如式 1），UGPase活性可直接影響UDPG的合成。其中葡萄糖-1-磷酸由磷酸葡萄糖變位酶（PGM）催化6-磷酸葡萄糖所得，因此PGM活性也會間接的影響UDPG的合成。所以這種酶普魯蘭多糖發酵起到尤為重要的影響。

圖4 pH值對UDPG焦磷酸化和磷酸葡萄糖變位酶酶活性的影響Fig.4 Effect of different pH on UDPG-pyrophosphorylase and phosphoglucomutase activity

從圖4總體可看出，在pH6.0～5.0條件下發酵80 h后UGPase和PGM的活性均高于其他pH條件下的活力，同時此條件下的多糖產量也高于其他組，這一結果顯示這些pH值條件下的酶活力與普魯蘭多糖的生產規律相似，因此證明了這兩種酶對多糖生產的影響。在初始pH6.0條件下UGPase和PGM的活性與pH6.0～4.5組相近，同時普魯蘭多糖產量相近，分別為（65.21±2.78）g/L 和 63.21 g/L，而此時初始pH6.0條件下的發酵pH值為4.76左右，證明這兩種酶的活性對pH值變化較為敏感。在后期控制pH值恒定的四組中酶活力受pH值影響，隨pH值由低到高，呈現一種先降低后升高的變化趨勢，并在pH5.0表現出最高比活力，同時可以觀測出普魯蘭多糖產量呈現這一態勢。從而可在酶學上印證后期調節pH值至5.0更利于普魯蘭多糖合成。而生物量的變化受酶活影響并不十分明顯，初始pH值6.0組在發酵80 h時酶活與pH6.0～4.5酶活基本一致而生物量卻差異明顯。后期調控pH值的四組，生物量則與pH值的變化相關，可看出后期pH值偏低更利于菌體生長。

2.5 雙階段pH6.0～5.0對普魯蘭多糖發酵的影響及機理分析

雙階段控制pH值對普魯蘭多糖發酵的影響見圖5。

圖5 雙階段控制pH值對普魯蘭多糖發酵的影響Fig.5 Change fermenting pullulan under two-phase control of pH value

利用5 L發酵罐對pH6.0～5.0組進行產量驗證，每隔8 h取樣一次。普魯蘭多糖多糖合成及生物量累積趨勢如圖5所示，普魯蘭多糖產量在發酵80h時達到最高，相較于僅調節初始pH6.0發酵時間縮短8 h左右，同時產量也有顯著提高，此時普魯蘭多糖產量達到（92.5±2.41）g/L，生物量達到（13.95±0.35）g/L。發酵80 h后繼續反應，普魯蘭多糖產量開始下降，同時生物量增高，發酵96 h生物量增高值（14.91±0.29）g/L，而普魯蘭多糖產量下降至（81.33±2.01）g/L。產生此現象可能是由于普魯蘭多糖積累到一定水平，對其合成產應產生抑制作用，從而使普魯蘭酶開始分解普魯蘭多糖，為菌體合成提供碳源，從而使生物量有明顯增長。UDPG含量的變化趨勢也同樣印證了這一點，UDPG含量先處于較高水平，隨普魯蘭多糖合成加劇，UDPG含量迅速下降并在多糖產量達到最高時處于最低谷，在多糖產量降低時又有些許上升。又經相關性檢驗得出兩者相關性系數為-0.905，則普魯蘭多糖產量與UDPG含量在0.01水平上顯著相關，由于相關性系數為負，所以兩者呈顯著負相關關系。

3 結論

經上述試驗證明，分階段控制pH值對于普魯蘭多糖合成以及出芽短梗霉菌體生長具有顯著的促進作用。分階段控制pH值的第一階段即初始pH值調節為6.0利于菌體生長和生物量積累，而第二階段控制pH值恒定于5.0誘導發酵，促進普魯蘭多糖合成，同時發酵終止時間提前8 h，最終生物量到達（13.87±0.89）g/L，終產量達到（92.5±2.41）g/L左右。經過驗證pH6.0～5.0此雙階段pH值調控方式可使PGM和UGPase活性高于其他控制階段，并且得出普魯蘭多糖產量與UDPG含量變化成顯著負相關關系。

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