微生物發酵制備富含共軛亞油酸酸豆乳的研究

高輝，李盟，朱振元，宋巧英，邱靖一，王藝臻，劉婷婷

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid簡稱CLA）是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱，是一種具有許多生理活性的天然脂肪酸，是亞油酸（Linoleic acid，18：2 n-6）的幾何異構體，其中每個雙鍵可為順式或反式構型。因其在18碳脂肪酸的碳鏈上的不同位置，至少包括了28種異構體，最常見的、最具有生理活性的異構體是c9，t11-CLA和t10，c12-CLA[1-4]。研究發現共軛亞油酸與亞油酸在空間結構、理化性質以及生理功能等方面都具有顯著差異，共軛亞油酸經腸粘膜吸收滲入到血脂、細胞膜及脂肪組織，或者經過代謝進一步合成一系列活性物質而發揮重要的生理功能[5]。此外，共軛亞油酸可以提高人體的免疫力，降低人體內脂肪含量，同時對抗癌，抗動脈粥樣硬化，預防糖尿病以及改善骨組織代謝有重要的生理意義[6-8]。更有對實驗老鼠進行研究，發現能減少致癌物引起的皮膚癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌和胸腺癌[9-11]。

隨著人類對保健食品的大量需求，共軛亞油酸的需求量也就逐漸增大。目前關于CLA的合成方法很多，其中主要包括生物合成法和化學合成法[12-13]。近年來，也有人研究利用超臨界流體的方法來萃取CLA[14]。化學合成法多采用堿異構法，轉化率一般較高，但合成產物異構體組成十分復雜，產物分離純化步驟較多，成本較高[15]。生物合成法是采用特定的酶或微生物催化相應的底物得到CLA，其中微生物合成法較為常用，許多微生物能夠通過發酵形成一種能夠合成CLA的酶[14]。目前常用生產CLA的有乳酸桿菌、丁酸弧菌、瘤胃菌、丙酸桿菌、真桿菌屬等[16-17]。

乳酸桿菌產CLA的能力近年來也已得到相當廣泛報道，基本涵蓋乳酸桿菌各個種屬。Lin[18]等研究表明，脫脂乳中亞油酸可被嗜酸乳桿菌（Lb.acidophilus）轉化為CLA。Kishino等[19]報道了一批微生物可將亞油酸轉化至共軛亞油酸，其中的一株植物乳桿菌（Lb.plantarum）可將高達85%的亞油酸轉化為c9，t11-CLA和t9，t11-CLA，同時發現這株植物乳桿菌AKU1009a甚至可直接利用蓖麻油酸和蓖麻油產CLA。

豆漿亞油酸含量高達51.7%～57%[20]。本試驗使用植物乳桿菌發酵豆漿制品，生產出富含共軛亞油酸的功能型固態酸豆乳。分別從豆漿的制備工藝條件優化以及植物乳桿菌產共軛亞油酸的最佳發酵條件的優化，不僅提高了豆漿中腸道有益菌的數量和豆漿蛋白質含量，也最大程度上完善了共軛亞油酸的生產。因此，本試驗對促進富含共軛亞油酸固態發酵豆乳制品的開發具有一定的研究價值和廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：市售散稱；脫脂奶粉：光明乳業股份有限公司；蔗糖、瓊脂：均為食品級市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：由天津科技大學生物資源與功能食品實驗室提供。

共軛亞油酸標準品：美國NU-CHEK公司；正己烷、氯仿、無水硫酸鈉、甲醇：天津江天化工技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Pico&Fresco臺式離心機：Heraeus美國科俊儀器有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫用核子儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；VS-1300L-U超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；UV-29200型紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司。

1.3 培養基

1.3.1 乳培養基

脫脂奶粉12g，蒸餾水100mL，115℃滅菌15min。

1.3.2 復壯培養基

MRS培養基：1.0%牛肉膏，1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，2.0%葡萄糖，0.1%吐溫-80，0.2%K2HPO4，0.5%乙酸鈉，0.2%檸檬酸二銨，0.02%MgSO4·7H2O 和 0.005%MnSO4·H2O（pH6.5），固體培養基加瓊脂1.8%～2.0%。121℃滅菌30 min。

1.3.3 菌種馴化培養基

逐漸減少脫脂還原乳比例，提高豆漿的比例，115℃滅菌15 min，備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 豆漿的制備工藝

稱100 g黃豆→加水浸泡→加一定量的水用勻漿機打制→過濾除去豆渣→加熱煮沸

1.4.2 豆漿中粗蛋白含量測定

對豆漿粗蛋白含量測定，檢測方法按照凱氏定氮法[21]。

1.4.3 豆漿制備單因素試驗

1.4.3.1 浸泡時間對豆漿蛋白質含量的影響

分別設置 4、8、12、15、18、20、22 h 7 組試驗，在水豆比10∶1（mL/g）的情況下制漿，然后測定豆漿蛋白質含量。

1.4.3.2 水豆比例對豆漿蛋白質含量的影響

分別設置不同水豆比 10 ∶1、11 ∶1、12 ∶1、13 ∶1、14∶1（mL/g）5組試驗，在泡豆時間15 h條件下制漿，然后測定豆漿蛋白質含量。

1.4.3.3 加熱時間對豆漿蛋白質含量的影響

在水豆比10∶1（mL/g）、泡豆時間15 h的條件下。首先在豆漿加熱前取一次樣，然后加熱，當豆漿沸騰開始計時，分別于沸騰后3、5、8、10 min時取一次樣，然后再測定豆漿蛋白質含量。

1.4.4 豆漿制備正交試驗的優化

根據以上單因素試驗結果，考察泡豆時間、水豆比例以及加熱沸騰時間，分別取不同的水平，設計L9（34）正交試驗，確定豆漿制備的最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design

1.4.5 菌種活化與馴化

1.4.5.1 菌種活化

在無菌條件下，將冷凍干燥的植物乳桿菌接種到滅菌后的乳培養基中，于37℃恒溫培養箱中培養至乳凝固，以5%的接種量繼續接種到乳培養基2代～3代，使菌種恢復活力。

1.4.5.2 菌種馴化與保藏

菌種恢復活力后，以5%接種量按照以下豆漿比例培養基馴化：活化乳培養基→20%豆漿培養基→40%豆漿培養基→60%豆漿培養基→80%豆漿培養基→100%豆漿培養基，觀察凝乳時間以及狀態。每一個濃度梯度都傳2代～3代，保證菌種在相應的濃度穩定傳代。在馴化過程中，菌種會退化，這時需要用1.3.2復壯培養基進行復壯。對馴化后的菌種進行低溫斜面保藏。

1.4.6 CLA標準曲線的測定

準確稱取共軛亞油酸標準品10.0mg放入100mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，振蕩使其充分溶解，此時共軛亞油酸標準液濃度為0.1 mg/mL，然后分 別 吸 取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL放入25 mL的容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成濃度分別為 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg/mL的標準溶液，以正己烷為參比在233 nm處測定吸光度，以共軛亞油酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制共軛亞油酸標準曲線。

1.4.7 CLA的提取

本文使用氯仿-甲醇法提取共軛亞油酸。首先取1 mL發酵液于離心管中，在加入2 mL的氯仿：甲醇（2∶1，體積比），振蕩均勻，于 4℃，5 000 r/min離心15 min，收集下層，加入一定量的無水硫酸鈉干燥，然后在30℃真空濃縮，最后用正己烷定容至10 mL，混勻以備檢測[22]。

1.4.8 CLA含量的測定

以正己烷為參比，在180 nm～290 nm紫外波長下進行掃描，讀取233 nm處的吸光度。若吸光度不在標準曲線范圍內，則再對樣品進行稀釋，然后再進行測定。

1.4.9 CLA生產的單因素試驗

通過預試驗分析以及為了提高發酵豆乳產品的品質，本文采用蔗糖作為甜味劑，瓊脂作為穩定劑、乳化劑，以及發酵時間和接種量這4個因素為主要研究對象進行試驗，以期為正交試驗準備。發酵基礎培養基為80%豆漿培養基。

1.4.9.1 發酵時間對CLA產量的影響

從馴化后的豆漿培養基以5%接種量接種到新的滅菌的豆漿基礎培養基中，不添加蔗糖和瓊脂，37 ℃下分別恒溫培養 12、18、24、30、36、42、48 h，發酵結束后測定共軛亞油酸含量。

1.4.9.2 接種量對CLA產量的影響

從馴化后的豆漿培養基分別以1%、2%、3%、4%、5%接種量接種到新的滅菌的豆漿基礎培養基中，不添加蔗糖和瓊脂，37℃培養24 h至乳凝固后提取發酵液，用于測共軛亞油酸含量。

1.4.9.3 蔗糖添加量對CLA產量的影響

分別設置蔗糖添加量為1%、3%、5%、7%、9%5個水平，每個水平以5%的量進行接種，并且設置空白對照組，不添加瓊脂，37℃培養24 h至乳凝固后提取發酵液，測定共軛亞油酸含量。

1.4.9.4 瓊脂添加量對CLA產量的影響

分別設置瓊脂添加量為0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%6個水平，每個水平以5%的量進行接種，并且設置空白對照組，不添加蔗糖，37℃培養24 h至乳凝固后，觀察其凝乳的穩定狀態并提取發酵液，測定共軛亞油酸含量。

1.4.10 培養條件的正交試驗設計

根據以上單因素試驗結果，考察發酵時間、接種量、蔗糖添加量以及瓊脂添加量，分別取不同的水平，設計L9（34）正交試驗，確定菌株產共軛亞油酸的最佳培養條件。

2 結果與討論

2.1 豆漿制備條件的優化

2.1.1 浸泡時間的優化

不同浸泡時間豆漿蛋白含量見圖1。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experimental design

圖1 不同浸泡時間豆漿蛋白含量Fig.1 Protein content of soymilk with different immersion

從圖1可以看出，隨著浸泡時間的增加豆漿蛋白質含量增加，這是由于黃豆經過浸泡后，蛋白質更容易溶出，但是當浸泡時間超過15 h后，豆漿蛋白質含量下降，可能是因為浸泡時間太長，黃豆浸泡液中有大量的白色乳液，這可能是蛋白質流失到浸泡液中。綜合考慮，本試驗采用8、12、15 h為浸泡時間的3個水平。

2.1.2 水豆比例條件的優化

不同水豆比例下豆漿蛋白含量見圖2。

圖2 不同水豆比例下豆漿蛋白含量Fig.2 Protein content of soymilk with different weight rations of water and beans

由圖2可知，隨著水豆比例的增加，豆漿逐漸被稀釋，豆漿中蛋白質的濃度也逐漸降低，為了提高豆漿的營養價值，經綜合考慮選用10∶1、11∶1、12∶1（mL/g）為水豆比例的3個水平。

2.1.3 加熱時間條件優化

不同加熱時間下豆漿蛋白含量見圖3。

圖3 不同加熱時間下豆漿蛋白含量Fig.3 Protein content of soymilk with different heating time

由圖3可知，隨著加熱時間的增加，豆漿溶液逐漸被濃縮，豆漿中蛋白質含量逐漸升高，但是當加熱時間超過8 min時，豆漿會出現糊味并且蛋白質在豆漿表面凝聚成一層厚厚的膜，使豆漿口感和顏色都欠佳。因此本試驗選用3、5、8 min為加熱時間的3個水平。

2.1.4 豆漿制備條件的正交試驗

正交試驗結果見表3。由表3極差分析可知，各因素的主次順序為B（水豆比例）＞C（加熱時間）＞A（泡豆時間）。通過單因素和正交試驗，確定豆漿制備的最佳條件為A3B1C3，即泡豆時間15 h，水豆比例10∶1（mL/g），加熱時間 8 min。豆漿蛋白質含量在此條件下為3.96%。

表3 L9（34）正交試驗結果Table 3The results of orthogonal experiment of L9（34）

2.2 菌種的馴化以及基礎培養基的選擇

通過對植物乳桿菌在不同豆漿濃度的培養基進行培養轉接，通過觀察凝乳時間以及生長特性，研究發現植物乳桿菌可以在100%豆漿培養基中較好的生長，而且具有穩定傳代的性狀。為了提高豆漿的營養價值，本試驗選用80%的豆漿培養基作為后續試驗的基礎培養基，并且對該濃度下馴化的菌種進行低溫斜面保藏，每次使用前都需要進行活化2次～3次后使用。

2.3 CLA標準曲線的繪制

CLA標準曲線見圖4。

圖4 CLA標準曲線Fig.4 Standard curve of CLA

由圖4可得到共軛亞油酸標準曲線，其線性回歸為Y=0.0739x+0.0314，其中Y代表233nm處的吸光度，x代表待測樣品共軛亞油酸濃度，R2=0.997 4說明回歸擬合效果較好。

2.4 菌株產共軛亞油酸條件的優化

2.4.1 發酵時間條件的優化

發酵時間對CLA產量的影響見圖5。

圖5 發酵時間對CLA產量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on CLA production

由圖5可得CLA產量隨著發酵時間的變化，在一定時間內，隨著時間的增加植物乳桿菌不斷生長繁殖，使亞油酸異構酶含量也增加，但是當時間超過36 h時，CLA產量逐漸降低，可能是隨著時間的延長乳酸菌產酸量增多導致培養基內pH值下降從而抑制了亞油酸異構酶活性。因此選用發酵時間24、30、36 h 3 個水平。

2.4.2 接種量條件的優化

接種量對CLA產量的影響見圖6。

圖6 接種量對CLA產量的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on CLA production

由圖6可得，隨著接種量的增加，培養基內乳酸菌繁殖更加旺盛，CLA產量也隨之增加。但是當接種量超過3%時，可能因為培養基內營養物質有限使菌種競爭性抑制加強導致菌種衰退甚至死亡，使CLA產量下降。本試驗選用2%、3%、4%為接種量3個水平。

2.4.3 蔗糖添加量條件的優化

蔗糖添加量對CLA產量的影響見圖7。

圖7 蔗糖添加量對CLA產量的影響Fig.7 Effect of sucrose content on CLA production

由圖7可得，隨著蔗糖添加量的增加，為植物乳桿菌生長提供了更多的碳源，CLA產量也逐漸增加。當添加量超過7%時，CLA產量逐漸降低，原因可能是高糖溶液使乳酸菌細胞處于高滲溶液從某種程度上抑制了乳酸菌的生長，且有文獻表明一定濃度的蔗糖溶液對CLA的生成有一定的抑制作用[23-26]。綜合考慮，本試驗選用6%、7%、8%為蔗糖添加量3個水平。

2.4.4 瓊脂添加量條件的優化

瓊脂添加量對CLA產量的影響見圖8。

由圖8可得，瓊脂添加量對CLA產量無較明顯的影響，但是當瓊脂添加量超過0.8%時，CLA產量顯著下降而且在培養基的溶解性以及凝乳效果都較差，可能是由于瓊脂量較多在某種程度上為植物乳桿菌的生長提供了阻力。因此，本試驗選用0.6%、0.7%、0.8%為瓊脂添加量的3個水平。

圖8 瓊脂添加量對CLA產量的影響Fig.8 Effect of agar content on CLA production

2.4.5 培養條件優化的正交試驗設計

正交試驗結果見表4。由表4極差分析可知，各因素的主次順序為B（接種量）＞A（發酵時間）＞C（蔗糖添加量）＞D（瓊脂添加量）。通過單因素和正交試驗K值推斷出最優結果為A3B3C1D3，然后再與編號6條件下所制得酸豆乳的共軛亞油酸產量進行驗證試驗，在A3B3C1D3條件下測得共軛亞油酸含量為29.68 μg/mL，此含量低于編號6條件下的共軛亞油酸產量，因此確定培養條件的最佳水平為A2B3C1D2，即蔗糖添加量6%、瓊脂添加量0.7%、接種量4%、培養時間30 h，其共軛亞油酸產量為29.83 μg/mL。

表4 L9（34）正交試驗結果Table 4The results of orthogonal experiment of L9（34）

3 結論

本試驗首先從單因素和正交試驗確定了豆漿制備的最佳工藝流程為：泡豆15h、水豆比例10∶1（mL/g）、加熱沸騰時間8 min，在此條件下，豆漿中蛋白質含量為3.96%。由于植物乳桿菌不能直接在豆漿培養基中生長，因此本文對乳酸菌在不同比例的豆漿培養基中進行馴化，最終選擇80%豆漿培養基為后續基礎發酵培養基。通過單因素和正交試驗確定菌株產CLA的最佳發酵條件為：蔗糖添加量6%、瓊脂添加量0.7%、接種量4%、培養時間30 h，在此條件下，最終得到的CLA產量為29.83 μg/mL。

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