裂殖壺菌培養物中二十二碳六烯酸含量的測量不確定度評定

李永凱，張鳳枰，廖利民，羅國強，蘇艷秋，，曾娟，楊建英，曹毅

（1.通威股份有限公司，四川成都610000；2.河南科技大學，河南洛陽471000；3.四川大學，四川成都610000）

俗稱“腦黃金”的二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），不僅是人體的必需脂肪酸[1-3]，而且對動物的生長發育和免疫有著特別重要的生理作用[4-7]。海洋產品中的魚油是DHA的主要傳統來源，隨著海洋漁業資源日漸減少，新的DHA來源開發已成為迫切需求。裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）可發酵產DHA，其產業化生產成為研究熱點[8-10]。發酵產品中DHA含量的準確測定是生產質控和科研中的一個重要環節，不但要求檢測方法方便快捷，而且還需要檢測方法具有較高的準確度。測量不確定度是國際上通用的衡量測量結果可靠性的指標，表征測量值的分散性[11]。它的正確評定在測量結果的客觀分析中具有重要意義，能夠量化測量結果的可信程度，使數據可以共享和比對。本研究采用氣相色譜內標法檢測裂殖壺菌固態發酵產物中DHA的含量，按照GUM等指南[11-13]，根據實驗原理和方法建立數學模型，結合實驗，分析檢測過程中各分量不確定度來源并量化后，使用統計方法計算合成，得到樣品DHA檢測結果的標準測量不確定度和擴展測量不確定度，旨在為發酵產品中DHA含量的質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Sartorius-CP225D電子分析天平：梅特勒-托利多國際有限公司；安捷倫7890A氣相色譜儀（配FID檢測器）：安捷倫科技（中國）有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；DKZ-2恒溫震蕩水槽、HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司。

十三烷酸、二十二碳六烯酸、三十七種脂肪酸甲酯混標（10 mg/mL）、14%三氟化硼-甲醇溶液等：均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；鹽酸、三氯甲烷、正己烷、甲醇、石油醚（60℃～90℃）、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉等：購自成都市科龍化工試劑廠；雙蒸水：通威股份有限公司水產科技園實驗室自制。

裂殖壺菌培養物樣品：由成都通威水產科技有限公司提供。

1.2 檢測方法

采用張鳳枰等方法[14]，參照國家標準GB 5009.168-2016《食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定》[15]進行。

1.2.1 標準溶液的制備

十三烷酸內標溶液制備方法：準確稱取500 mg十三烷酸標準品（準確至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至50 mL，得到10.0 mg/mL的內標溶液，儲存于4℃冰箱備用。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 酸水解提取

裂殖壺菌培養物樣品粉碎，混合均勻，稱取0.5 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL離心管中，準確加入10 mg/mL十三烷酸內標溶液1 mL，然后加入6 mol/L的鹽酸溶液10 mL，混勻后置于60℃的恒溫震蕩水槽，震蕩頻度100次/min，時間30 min，取出后沸水浴5 min后，立即放入-20℃冰箱中冷凍8 h。冷凍消融后加入20 mL 三氯甲烷-甲醇（1∶1，體積比）混合溶劑，漩渦混勻2 min，然后8 000 r/min離心5 min，取氯仿層，加入等體積的0.1%氯化鈉溶液，混勻，再次離心，將氯仿層移至干燥的250 mL磨口三角瓶中，旋轉蒸發除去溶劑，得到油脂提取物。

1.2.2.2 油脂的皂化甲酯化

在所得油脂提取物的250 mL磨口三角瓶中加入0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液10 mL，置于100℃水浴上回流20 min后立即加入7 mL 13%～15%的BF3-CH3OH于沸騰的溶液中，繼續煮沸，回流10 min。加入20 mL正己烷于沸騰的混合溶液中，停止加熱，然后加入10 mL飽和氯化鈉溶液，漩渦混合1 min，靜置分層，移取3 mL上清液于潔凈試管中，加入適量無水硫酸鈉脫水，移取1 mL上層脫水溶液于樣品瓶中待測備用。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱型號：Supelco SPTM-2560石英毛細管柱，100 m×0.25 mm×0.20 μm；汽化室溫度設置：250℃；檢測器溫度設置：260℃；色譜柱初始溫度設置60℃，然后以每分鐘4℃升溫到160℃，再以每分鐘2℃升溫到240℃；載氣：高純度氮氣；分流比設置10∶1；色譜柱流速每分鐘1.0 mL；尾吹流速每分鐘40 mL；氫氣流的速設置每分鐘35 mL；空氣的流速設置每分鐘350 mL；進樣量為 1 μL。

1.2.4 測定

氣相色譜設備按上述條件設置，待氣相色譜基線穩定后，分別進樣檢測標樣、試樣溶液，進行氣相色譜檢測分析。以峰的保留時間定性，內標法計算DHA的含量。

1.3 測量模型

式中：X為裂殖壺菌培養物中DHA的含量，mg/100 g；Fi為DHA校正因子；Ai為DHA氣相色譜的出峰面積積分；AC13為十三烷酸甲酯的氣相色譜出峰面積積分；CC13為十三烷酸內標溶液濃度，mg/mL；VC13為加入的十三烷酸內標溶液量，mL；m為裂殖壺菌培養物質量，g；1.065 6為十三烷酸的甲酯化的轉化系數；0.959 0為DHA甲酯變成DHA的轉化系數。

2 結果與討論

裂殖壺菌培養物DHA含量的氣相色譜內標法檢測過程有6個環節引入了不確定度，分述如下：

2.1 校正因子測定環節

以脂肪酸甲酯混合標準溶液進樣，用氣相色譜做六次平行檢測，用1.3模型公式計算校正因子，6次測定數值分別為 1.046 1、1.041 3、1.050 7、1.044 6、1.042 9、1.043 3。

標準不確定度采用平均值的標準偏差：

十三烷酸甲酯和二十二碳酸六烯酸甲酯的純度均為99.9%，最大允差為0.1%。計算它們引入的相對標準不確定度urel（IS1）和urel（ISP）：

重復測定過程中產生的相對標準不確定度：

2.2 裂殖壺菌培養物樣品稱量環節

試驗所用萬分之一電子分析天平的不確定度為0.05 mg，按測量不確定度B類評定，均勻分布，K=計算由裂殖壺菌培養物樣品稱量環節產生的不確定度：

校正因子測定環節引入的相對標準不確定度：

2.3 十三烷酸內標溶液配制環節

試驗所用的十三烷酸的純度為99.0%，最大允差為1.0%，按照均勻分布計算相對標準不確定度：

十三烷酸稱量所用分析天平與2.2相同，因此十三烷酸標準品稱量產生的不確定度：

十三烷酸內標配制過程中器量校準引起的相對標準不確定度urel（ISV）：體積校準、定容操作、溫度變化等分別引入 3 個分量 urel1（V）、urel2（V）和 urel3（V），3個分量的合成相對標準不確定度urel（V）計算結果見表1[16，17]。

表1 單標線吸量管、單標線容量瓶的相對標準不確定度Table 1 The relative standard uncertainty of suction pipet and volumetric flask

試驗中使用50 mL容量瓶引起的體積相對標準不確定度：

綜上，計算十三烷酸內標溶液配制環節引入的相對不確定度：

2.4 內標使用環節

使用1 mL吸量管加入十三烷酸內標環節引入的相對標準不確定度

2.5 重復檢測環節

裂殖壺菌培養物平行檢測6次，結果是每百克樣品中含 DHA 的毫克數分別是 719.0、684.0、693.0、702.5、715.3、669.0，平均值為697.1，計算標準不確定度：

2.6 加標回收試驗環節

加標回收試驗按3個水平，每個水平做2個重復進行實驗，結果見表2。

重復檢測環節引入的相對標準不確定度：

表2 樣品回收率測定值Table 2 The result of spike recovery

計算標準不確定度：

加標回收試驗環節引入相對測量不確定度：

2.7 合成總不確定度

由以上6個環節的不確定度計算合成不確定度

合成標準不確定度uc（X）：

uc（X）=ucrel（X）×X=9.8 mg/100 g

各分量不確定度按正態分布分析處理，根據正態分布，包含因子k=2，對應包含概率p=95%，擴展不確定度U計算結果如下：

U=k×uc（X）=19.6 mg/100 g

2.8 測量不確定度報告

裂殖壺菌培養物中的DHA含量：X=（697.1±19.6）mg/100 g，k=2

2.9 討論

以各不確定度分量值做圖進行直觀分析，如圖1所示。

圖1 測量不確定度分量示意圖Fig.1 Distribution diagram of each component of uncertainty

試驗過程中重復測定環節所引入的不確定度分量（1.12%）最大，稱量操作環節引入的不確定度分量（0.005 8%）最小。前者是后者的193倍。十三烷酸內標溶液配制、內標添加量、回收率、校正因子等分量不確定度介于0.15%和0.58%之間，各分量數值相差不大，但也不容忽視。本試驗結果與張鳳枰[14]研究結果相一致。通過以上分析，可以看出實驗手工操作部分帶來的不確定度相對較大，提示我們操作人員在檢測實驗中，應注意提高實驗操作技能，降低相關不確定度分量。

3 結論

根據氣相色譜內標法測定裂殖壺菌培養物中DHA含量的檢測方法和原理，建立數學模型，通過實驗數據統計評定得出：裂殖壺菌培養物DHA含量的重復測定環節所引入的不確定度分量最大，稱量操作環節最小，前者是后者的193倍；樣品中DHA含量檢測值697.1 mg/100 g，合成標準不確定度9.8 mg/100 g，擴展不確定度19.6 mg/100 g。

[1]Judge M P,Cong X,Harel O,et al.Maternal consumption of a DHA-containing functional food benefits infant sleep patterning：An early neurodevelopmental measure[J].Early Human Development,2012,88(7):531-537

[2]Minns L M,Kerling E H,Neely M R,et al.Toddler formula supplemented with docosahexaenoic acid(DHA）improves DHA status and respiratory health in a randomized,double-blind,controlled trial of US children less than 3 years of age[J].Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids,2010,82(4/6):287-293

[3]Swanson D,Block R,Mousa S A.Omega-3 fatty acids EPA and DHA：health benefits throughout life[J].Advances in Nutrition(Bethesda,Md.）,2012,3(1):1-7

[4]Hamazaki T,Itomura M,Sawazaki S,et al.Anti-stress effects of DHA[J].BioFactors(Oxford,England),2000,13(1/4):41-45

[5]Olsen Y,Evjemo J O,Kj?rsvik E,et al.DHA content in dietary phospholipids affects DHA content in phospholipids of cod larvae and larval performance[J].Aquaculture,2014,428/429:203-214

[6]Villalta M,Estévez A,Bransden M P,et al.The effect of graded concentrations of dietary DHA on growth,survival and tissue fatty acid profile of Senegal sole(Solea senegalensis)larvae during the Artemia feeding period[J].Aquaculture,2005,249(1/4):353-365

[7]Wu A,Ying Z,Gomez-Pinilla F.The salutary effects of DHA dietary supplementation on cognition,neuroplasticity,and membrane homeostasis after brain trauma[J].Journal of Neurotrauma,2011,28(10):2113-2122

[8]Yang H L,Lu C K,Chen S F,et al.Isolation and characterization of Taiwanese heterotrophic microalgae：Screening of strains for docosahexaenoic acid(DHA)production[J].Marine Biotechnology,2010,12(2):173-185

[9]Fedorova-Dahms I,Marone P A,Bauter M,et al.Safety evaluation of DHA-rich Algal Oil from Schizochytrium sp.[J].Food and Chemical Toxicology,2011,49(12）：3310-3318

[10]Tang S,Qin C,Wang H,et al.Study on supercritical extraction of lipids and enrichment of DHA from oil-rich microalgae[J].Journal of Supercritical Fluids,2011,57(1):44-49

[11]ISO/IEC.Guide 98-3-2008 Guide to the expression of uncertainty in measurement[S].日內瓦：國際標準化組織標準ISO,2008

[12]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-GL05：2011測量不確定度要求的實施指南 [S].北京：中國合格評定國家認可委員會,2011

[13]中國合格評定國家認可委員.CNAS-GL06：2006化學分析中不確定度的評估指南[S].北京:中國合格評定國家認可委員,2006

[14]張鳳枰,曹靜,杜雪莉,等.魚丸中DHA含量測量不確定度評定.[J].中國食品學報,2015(11):234-239

[15]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會,國家食品藥品監督管理總局．GB 5009.168-2016食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定[S].北京:中國標準出版社,2016

[16]杜雪莉,饒瑾瑜,張鳳枰,等,氣相色譜法測定水產預混合飼料中肌醇含量的不確定度評定[J].中國漁業質量與標準,2015(5):61-66

[17]國家質量監督檢驗檢疫總局．JJG 196—2006常用玻璃量器檢定規程[S].北京:中國計量出版社,2006