豬流行性腹瀉病毒流行株M基因的克隆與序列分析

丁衛星，王榮談，李春華，，夏 葉，郭佳宏，倪建平，繆德年，*，趙 敏*

（1上海瑞豐農業科技有限公司，上海201106；2上海市農業科學院上海種豬工程技術研究中心，上海201106；3上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海201106；4上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）

豬流行性腹瀉是一種由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的，以嚴重的腸炎、腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬高死亡率為顯著特征的豬急性高度接觸性腸道傳染?。?］。自2010年底中國豬流行性腹瀉疫情暴發以來，該病持續在中國流行蔓延，給養豬生產帶來了巨大的經濟損失，直至2015年中國部分地區的豬場仍然發病嚴重［2-4］。PEDV基因組全長為28 033 nt，編碼4種主要結構蛋白［纖突蛋白（Spike protein，S）、小包膜蛋白（Envelope，E）、膜糖蛋白（Membrane，M）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）］和4種非結構蛋白（1a、1b、3a、3b）。其中M蛋白（27—32 kD）在病毒囊膜蛋白中含量最多，并通過與S蛋白和N蛋白互作參與病毒的組裝。M蛋白具有跨膜結構，短的N末端結構域位于病毒外，C端結構域在病毒內［1］。在補體存在的條件下，M蛋白可誘導機體產生中和抗體，而且M蛋白還可以誘導α干擾素的產生［5］。本研究克隆了發病豬群臨床分離株PEDV D1和D3的M基因序列，并分析目前我國PEDV流行毒株M蛋白的抗原性，以期為PEDV疫情診斷方法的建立和防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

PEDV臨床毒株D1和D3分離自具有腹瀉臨床癥狀的仔豬。大腸桿菌JM109感受態細胞、pMD18-T載體、RNA提取試劑盒、高保真Prime STAR HSDNA聚合酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker、質粒小量提取試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.2 引物

從GenBank中下載近年來流行的PEDV M基因核苷酸序列，經比對后根據其保守序列設計1對引物，用于 M基因的擴增。M1：5’-AGTCTTACATGCGAATTGACC-3’，M2：5’-AGCTGACAGAAGCCATAAAGT-3’，擴增片段大小為777 bp，引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

1.3 樣品處理

按照RNA提取試劑盒說明書提取PEDV臨床毒株D1和D3的總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PEDV M基因的PCR擴增（98℃2 min；98℃10 s，55℃10 s，72℃1 min，30個循環；72℃延伸10 min）。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PEDV M基因的克隆與序列測定

將PEDV M基因的PCR產物純化回收后，克隆于pMD18-T載體中，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，在LB培養基中過夜培養，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，以PCR方法鑒定重組質粒，陽性質粒交寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.5 PEDV M基因遺傳進化分析

采用DNAStar軟件對測得的PEDV D1和D3的M基因序列與我國其他地區的分離株以及國外分離株（表1）的PEDV M基因進行同源性分析，采用MegAlign軟件構建系統進化樹。

表1 用于進行M基因序列比較的PEDV毒株Table 1 PEDV strains for sequence com parison of M gene

1.6 PEDV M蛋白二級結構與抗原性分析

利用DNAStar軟件Protein不同方法對其進行二級結構預測。運用在線軟件預測可能存在的抗原位點（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）。

2 結果與分析

2.1 M基因的擴增

利用RT-PCR方法擴增PEDV臨床毒株D1和D3的M基因全長，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預期大小相一致，約為777 bp（圖1）。

圖1 豬流行性腹瀉病毒M基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of M gene of PEDV

2.2 PEDV M基因序列分析

每個分離毒株取2個陽性質粒送公司測序。測序結果表明：相同毒株的M基因序列完全一致，PEDV分離株D1和D3的M基因大小分別為693 bp和681 bp，分別編碼231個和227個氨基酸。以GeneBank上登錄的CV777（AF353 511.1）作為參考，分析M基因堿基的變化，發現D1株存在12個核苷酸的插入［TTATGCTAGTAC（35—46）］，3個核苷酸的突變（C198T、T388C、C448T），導致氨基酸存在 4氨基酸（MLVL）的插入（13—16）和2個位點的氨基酸發生改變（C134R、L154F）。D3株存在12個核苷酸的突變（G37C、T125C、G180A、C198T、C213T、C222T、C234T、T285C、T348A、A603C、T618C、G640T），導致 3個位點的氨基酸發生改變（E13Q、V42A、A214S）（圖 2）。

圖2 分離株D1和D3的M基因序列Fig.2 M gene sequence of PEDV isolates D1 and D3

2.3 M基因序列同源性及進化樹分析

運用DNAStar軟件將流行毒株的M基因序列與GenBank上已發表的M基因參考序列進行比較分析，結果顯示：流行毒株M基因之間的核酸序列同源性為98.1%，M蛋白之間的氨基酸序列同源性為97.8%；與參考毒株核苷酸和氨基酸的相似性分別為97.2%—100%和96.9%—100%。系統發育樹結果表明：流行毒株 D1與參考株 EAS1、SM98、CHM2013分離株親緣性較近，流行毒株 D3與參考株PEDV-LY、PEDV-WS、CH22分離株親緣性較近，處于同一分支（圖3）。

圖3 根據PEDV M基因序列繪制系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the sequence of PEDV M gene

2.4 M蛋白二級結構和抗原表位的預測

對PEDV D1株M蛋白來說，Garnier-Robson法計算出特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性結果是α-螺旋區域有9個區段，β-折疊區域有18個區段。用Chou-Fasman法預測的結果為α-螺旋區域有1個區段，β-折疊區域有12個區段。用Karplus-Schulz法預測蛋白質骨架區的柔韌性表明：有12個區域為柔韌區域。用Jameson-Wolf法預測M蛋白潛在的抗原決定簇，結果顯示：1—10位、18—21位、105—124位和185—228位這幾個區段的抗原指數較高。對PEDV D3株M蛋白來說，Garnier-Robson法計算出特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性結果是α-螺旋區域有8個區段，β-折疊區域有14個區段。用Chou-Fasman法預測的結果為沒有α-螺旋區域，有7個β-折疊區域。用 Karplus-Schulz法預測蛋白質骨架區的柔韌性表明：有8個區域為柔韌區域。用Jameson-Wolf法預測M蛋白潛在的抗原決定簇，結果顯示：1—17位、102—118位和182—223位這幾個區段的抗原指數較高。對PEDV CV777參考株M蛋白來說，Garnier-Robson法計算出特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性結果是α-螺旋區域有10個區段，β-折疊區域有17個區段。用Chou-Fasman法預測的結果是α-螺旋區域有1個區段，β-折疊區域有11個區段。用Karplus-Schulz法預測蛋白質骨架區的柔韌性表明：有12個區域為柔韌區域。用Jameson-Wolf法預測M蛋白潛在的抗原決定簇，結果顯示：1—17位、102—118位和182—223位這幾個區段的抗原指數較高。

2.5 M蛋白抗原位點在線預測

運用在線軟件（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）預測可能存在的抗原位點，結果表明：PEDV D1株M蛋白的抗原位點預測分析出7個抗原決定簇，平均抗原傾向為1.0617，其極可能的抗原位點氨基酸殘基為4—17位、26—103位、120—126位、132—177位、179—189位、199—205位和208—225位；PEDV D3株M蛋白的抗原位點預測分析出7個抗原決定簇，平均抗原傾向為1.0633，其極可能的抗原位點氨基酸殘基為4—14位、22—99位、116—122位、125—173位、175—185位、195—201位和204—222位；PEDV CV777株M蛋白的抗原位點預測分析出7個抗原決定簇，平均抗原傾向為1.0628，其極可能的抗原位點氨基酸殘基為4—13位、22—99位、116—122位、125—173位、175—185位、195—201位和204—221位。

3 討論

自1982年我國首次分離到PEDV后，一些省份或地區陸續有報道 PEDV的感染與發病，PED已經成為我國養豬業主要的傳染病之一。從2010年末到現在，PEDV一直持續在我國豬群中流行，導致大量的新生仔豬發病死亡，因此該病的流行引起了人們的廣泛關注［6］。從不同省市采集的樣品檢測結果顯示，有些省份PEDV感染率極高，即使未發病豬場也有PEDV的潛在感染［7］。雖然PEDV只有一種血清型，但分子生物學分析表明PEDV的基因組存在基因多樣性。本課題組獲得了2株中國PEDV毒株的M基因全序列，測序結果顯示：與經典株CV777相比，D1株M基因存在12個核苷酸的插入TTATGCTAGTAC（35—46），3個核苷酸的突變（C198T、T388C、C448T），導致蛋白存在4氨基酸（MLVL）的插入（13—16），2個位點的氨基酸發生改變（C134R、L154F）；D3株M基因存在12個核苷酸的突變（G37C、T125C、G180A、C198T、C213T、C222T、C234T、T285C、T348A、A603C、T618C、G640T），導致 3個位點的氨基酸發生改變（E13Q、V42A、A214S）。系統發育樹結果表明：流行毒株D1與參考株 EAS1、SM98、CHM2013分離株親緣性較近，流行毒株D3與參考株PEDV-LY、PEDV-WS、CH22分離株親緣性較近，而均與參考株CV777和早期分離株JS2008的親緣關系較遠。上述研究結果與吳玉璐等［8］、盧冰霞等［9］、黃冬妮等［10］的研究結論一致。另外，本試驗發現PEDV D1與D3株核苷酸的插入或突變對M蛋白的二級結構產生了明顯的影響，特別是PEDV D1株的抗原性位點也發生了重要變化，這可能是導致經典疫苗株免疫效果不理想的原因之一，這就給PEDV的研究和防控指明了方向。未來的工作更需重視研究PEDV的變異及其對致病力和免疫效果的影響，為新一代PEDV疫苗的研究提供依據。

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［3］SU Y，LIU Y，CHEN Y，et al.Detection and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus in central China based on the ORF3 gene and the S1 gene［J］.Virol J，2016，13（1）：192.

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［6］朱迪國，宋建德，袁麗萍，等.2013—2014年全球豬流行性腹瀉重大疫情分析［J］.中國動物檢疫，2014，31（10）：42-46.

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［8］吳玉璐，虞凌雪，程群，等.豬流行性腹瀉病毒 M基因的表達及鑒定［J］.中國動物傳染病學報，2012，20（6）：6-10.

［9］盧冰霞，秦毅斌，何穎，等.2011—2014年廣西豬流行性腹瀉病毒檢測及其 M基因的序列分析［J］.中國畜牧獸醫，2015，42（3）：549-557.

［10］黃冬妮，黃良宗，馬春全，等.廣東省豬流行性腹瀉病毒ORF3和M基因的克隆與序列分析［J］.黑龍江畜牧獸醫，2015（5）：136-139.