金魁獼猴桃RT-qPCR內參基因的篩選

張計育，黃勝男，王 濤，潘德林，翟 敏，郭忠仁

（江蘇省中國科學院植物研究所，南京210014）

實時熒光定量PCR（Reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR）技術是對PCR反應中每一個循環的產物進行定量分析，具有特異性強、靈敏度高、定量準確、速度快等優點，已成為研究基因功能的重要方法之一。選擇較為穩定的內參基因是利用RT-qPCR方法進行基因表達分析的基礎。目前，常用的內參基因有肌動蛋白基因（Actin，ACT）、18S rRNA基因、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因、微管蛋白基因（Tubulin）等。RT-qPCR反應中所需的內參基因在各種類型的組織、細胞和各種試驗因素條件下均需恒定表達。近年來，關于RT-qPCR試驗內參基因的選擇已經在許多物種中進行了研究，包括葡萄［1］、甘蔗［2］、白楊［3］、香蕉［4］、荔枝［5］、柑橘［6］、木瓜［7］、蘋果［8］、桃［9］等，發現沒有一個內參基因在任何組織、任何試驗條件下絕對穩定的表達。目前，關于獼猴桃組織特異性表達中內參基因選擇的研究還未見報道。本試驗以獼猴桃（Actinidia deliciosa）優良品種‘金魁’為材料，研究 6個常用的內參基因在不同組織中的表達特性，并利用 geNorm［10］、NormFinder［11］、BestKeeper［12］3種軟件分別評價6個候選內參基因的穩定性，以期為研究獼猴桃各組織中基因表達分析選擇穩定的內參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘金魁’獼猴桃5年生扦插苗，2016年4—5月取其根、莖、葉、花瓣、花萼、雌蕊、子房、幼果（花后10 d），于液氮中速凍保存用于后續RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA的合成

RNA的提取采用改良的CTAB法［13］。RNA的完整性用2%的瓊脂糖凝膠溴化乙錠染色檢測。RNA濃度和純度通過在NanDropND-2000分光光度計上測230 nm、260 nm、280 nm的值確定。cDNA合成采用能消除殘留DNA的試劑盒PrimeScript RT reagent kitwith gDNA Eraser（TaKaRa，Japan）進行，每個RNA樣品取1μg，具體方法參考說明書。

1.2.2 引物設計和RT-qPCR分析

選取6個內參基因進行RT-qPCR試驗以檢測其穩定性，包括最常用的ACT基因、親環蛋白基因（Cyclophilin，CYP）、RNA聚合酶亞基2基因（RNA polymerase subunit2，RP2）、GAPDH基因、β-微管蛋白基因（β-tubulin，TUB）、α-微管蛋白基因（α-tubulin，TUA）。其中 ACT基因的引物參照 Zhang等的報道［14］，其余5個內參基因的序列來源于獼猴桃基因組數據庫（http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi），引物設計采用Beacon Designer軟件進行，引物序列如表1。采用RT-qPCR方法確定內參基因的表達水平，應用Applied BiosystemsTM7300 Real Time PCR System，20μL反應體積中包含1.5μL 10倍稀釋后的cDNA，0.3μL（10 pmol/L）上、下游引物，10μL SYBR熒光染料（TaKaRa code：DRR041A）和7.9μL無菌ddH2O。PCR反應條件：94℃4 min；94℃30 s，60℃20 s，72℃43 s，40個循環。最后一個循環之后，利用熱熔解曲線（55—95℃）監控每個PCR擴增的特異性。利用7300系統軟件和2－ΔCt方法分析候選基因的表達水平。

表1 獼猴桃6個內參基因的引物序列Table1 Primer sequences of the 6 reference genes in kiwifruit

1.2.3 數據分析

參照公式Q＝2ΔCt，根據每個擴增樣品的Ct值計算各基因的相對表達量Q。△Ct＝Ct x－Ct樣品（Ct x為所有樣品中最低的 Ct值，Ct樣品為每個樣品的 Ct值）。利用 geNorm［10］、NormFinder［11］、BestKeeper［12］3種軟件分別評價6個候選基因在獼猴桃不同組織中表達的穩定性，比較穩定值大小以確定適宜的內參基因。

圖1 獼猴桃不同組織總RNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Agarose gel analysis of total RNA extracted from different tissues of kiw ifruit p lant

2 結果與分析

2.1 RNA質量分析

利用CTAB法從獼猴桃不同組織中提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明：獼猴桃所有樣品電泳圖譜28S rRNA和 18S rRNA條帶清晰（圖 1），無彌散帶，且28S rRNA亮于18S rRNA，說明在提取過程中幾乎沒有RNA降解現象。核酸定量檢測結果表明：在所有的RNA樣品中，其A260/A280比值介于1.90—2.15（表2），表明所提取的RNA較少有蛋白質等的污染。同時，A260/A230的比值均大于2.0（表2），說明RNA純度較高，沒有糖類、鹽類和有機物質等的污染。獼猴桃不同組織中總RNA的產量依材料不同存在較大的差別（表2），其中子房中的RNA含量最高，為1 105.7 ng/μL，花瓣中的含量最低，為398.79 ng/μL。以上結果表明，提取的RNA符合后續分子生物學試驗的要求。

表2 獼猴桃不同組織總RNA提取質量的比較Table 2 Comparison of the quality of total RNA extracted from different kiwifruit tissues

2.2 引物質量檢測

為了確定所設計內參基因引物擴增的單一性，以獼猴桃葉片的第一鏈cDNA為模板，進行RT-PCR分析。結果表明：6個內參基因引物擴增的熔解曲線均只有明顯的單一峰（圖3），說明所用引物都能特異性地擴增各內參基因的相應產物，不存在引物二聚體，RT-qPCR的結果準確可靠。

圖2 獼猴桃內參基因RT-qPCR擴增產物熔解曲線分析Fig.2 Melting curve analysis of RT-qPCR amplications product of kiwifruit reference genes

2.3 內參基因在不同組織中表達特性分析

利用比較Ct法分析內參基因在獼猴桃不同組織中的表達特性（圖3），結果表明：ACT和TUA基因在各組織中的表達量差異較小，表達相對穩定。GAPDH、RP2、CYP、TUB基因在獼猴桃各組織中的表達量差異較大。GAPDH基因在根中的表達量最高，在花瓣中的表達量最低。RP2在葉中的表達量最高，其次是子房，在花萼中的表達量最低。CYP基因在根中的表達量最高，在莖中的表達量最低。TUB在莖中的表達量最高，其次是雌蕊，在花萼中的表達量最低。

2.4 內參基因穩定性分析

利用geNorm軟件計算出所有基因與其他候選基因所得配對變異值的平均值M，M值越小，表明所選的內參基因越穩定。結果表明：CYP、TUB、RP2、GAPDH、TUA、ACT基因的 M值依次為 1.577、1.317、1.121、0.804、0.340和0.340，即表達穩定性由高到低為ACT＝TUA＞GAPDH＞RP2＞TUB＞CYP（表3）。根據NormFinder軟件分析可得（表3），ACT基因在獼猴桃不同組織中表達最為穩定，為最適內參基因，其次是TUA基因，CYP基因表達穩定性最差。BestKeeper軟件的分析結果與NormFinder軟件分析結果相同（表3）。可以得出，ACT基因是獼猴桃不同組織中表達最為穩定的內參基因。

圖3 獼猴桃內參基因在各組織中的表達特性分析Fig.3 Expression analysis of reference genes in different tissues of kiw ifruit p lant

表3 利用geNorm，Norm Finder和BestKeeper軟件計算的不同內參基因表達穩定性的順序Table 3 Ranking of candidate reference genes in order of their expression stability calculated by geNorm，Norm Finder and BestKeeper

3 討論

RT-qPCR是有效、快速、可靠的檢測基因表達的方法之一，在探索基因功能方面起到了重要的作用。通常情況下，在不同物種、不同品種、不同組織以及不同的試驗條件，選擇的內參基因是不同的。為了得到更加準確的基因表達結果，在進行基因表達研究之前，必須對內參基因進行穩定性評估，從而選擇更加穩定合適的內參基因。Yeap等［15］在5個不同的試驗設計下對油棕中14個內參基因進行了穩定性評估，結果表明：油棕生殖器官中表達穩定的內參基因是赤霉素響應蛋白2基因（Gibberellin-responsive protein 2，GRAS）和鈣調蛋白基因（Glutaredoxin）；果皮不同發育階段表達穩定的內參基因是GRAS和親環蛋白基因（Cyclophilin 2，Cyp2）；營養器官和油棕其他器官中表達穩定的內參基因是Cyp2、GRAS和信使RNA前體剪切因子SLU7（Pre-mRNA splicing factor SLU7，SLU7）；油棕所有組織中最穩定的內參基因是GRAS。Upadhyay等［16］對葡萄中10個內參基因進行了穩定性研究，發現在葉軸伸長過程中，tubulin、EF1α和UBC基因穩定表達，在花和漿果發育階段，PP2A、SAND、Sutra基因表達穩定。Tong等［9］利用相關軟件對11個內參基因在‘雨花1號’和‘京玉’桃不同cDNA樣品中表達的穩定性進行了比較分析，發現內參基因TEF2、UBQ10和RP II在所有的供試樣品中表達穩定，可以用于總樣品組合中桃果實果膠物質降解相關基因的表達分析。Kim等［19］對李子中20個候選內參基因在141個樣品中的表達進行了穩定性評估，發現SAND蛋白相關交換蛋白基因（SAND protein related trafficking protein，MON）、延長因子 1α基因（Elongation factor 1 alpha，EF1α）、起始因子5A（Initiation factor 5A，IF5A）是所有樣品中表達較為穩定的內參基因，可以用于基因表達研究。本研究對‘金魁’獼猴桃8個不同組織的6個內參基因的表達穩定性進行了研究，結果表明：ACT基因在不同組織的表達較為穩定，可以作為基因在組織中表達研究的內參基因。

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