IL-38通過調控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路抑制骨質疏松的機制研究

劉珍星 張山鋒 楊鐘華

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢普愛醫院骨科，武漢 430034)

骨質疏松是一種常見的骨科疾病，以骨密度降低、骨微結構破壞、伴隨骨脆性增加、易發生骨折為主要特征的全身性代謝性骨病[1]。在成年脊椎動物的骨重建過程中，成骨細胞調控的骨形成和破骨細胞調控的骨吸收兩個過程持續不斷地交替發生，使得骨骼不斷更新，從而維持骨代謝穩態，骨質疏松患者的這種穩態被破壞是導致發病的主要原因[2]。研究表明，骨質疏松患者的骨髓基質細胞增殖能力及分化成骨細胞的能力顯著降低[1,3]。PI3K/Akt信號通路作為調控成骨細胞和破骨細胞功能的信號通路網絡的中心，在正常生理刺激和病理狀態下對維持骨組織動態平衡具有重要作用[4]。PI3K/Akt信號通路對于破骨細胞的存活是至關重要的，而PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路在RANKL引起的破骨細胞形成和分化過程中扮演著非常重要的角色[4,5]。IL-38作為新近發現的細胞因子，其生物學功能尚未十分明確[6]。IL-38是IL-36的部分受體拮抗劑，它可作為IL-36的特異性受體[6]。IL-38可抑制Th17細胞產生IL-17和IL-22等炎癥介質，也可抑制IL-36γ誘導產生IL-8，發揮抑制炎癥反應的作用[6,7]。本次研究探討骨質疏松患者血清中IL-38的表達水平，同時通過骨質疏松小鼠模型，探討IL-38抑制骨質疏松的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 共納入2014年6月～2016年12月我院收治的138例骨質疏松患者作為研究對象；所有患者中男性33例，女性105例；患者年齡55～72歲，平均(60.8±11.3)歲。另選取120例同期在我院骨科進行骨折手術的無骨質疏松患者作為對照；對照組患者中男性27例，女性93例；患者年齡55～78歲，平均(58.7±18.3)歲。納入研究組的所有患者均符合骨質疏松的診斷標準，即出現周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統受損等臨床表現；骨密度檢查顯示骨量降低骨峰值的2倍標準差(-2.0SD)，或下降25%。排除長期營養不良及低鈣飲食患者；排除長期臥床患者；排除伴有全身其他器官器質性疾病患者；排除惡性腫瘤患者；排除近期及長期服用影響骨代謝藥物患者；排除并發其他代謝性疾病患者。納入研究的所有患者均簽署知情同意書，研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 主要試劑包括人IL-38 ELISA試劑盒(美國R&D Systems)，ALP檢測試劑盒(美國貝克曼公司)，p-PI3K、PI3K、p-NFATc1、NFATc1抗體(美國Abcam公司)，p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β抗體(美國Santa Cruz公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，Lipofectamine?2000轉染試劑(Thermo Fisher)，CCK-8檢測試劑盒、SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術有限公司)。DMEM培養基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)。野生型與IL-38轉基因小鼠購自武漢大學實驗動物中心，MC3T3-E1細胞購自美國ATCC公司。主要設備包括CO2培養箱、超凈工作臺、Tecan酶標儀、流式細胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad Western blot化學發光成像系統。

1.2方法

1.2.1小鼠模型 野生型與IL-38轉基因雌性小鼠各30只，使用前用鼠尾鑒定確認小鼠的基因類型。將各組小鼠隨機分為VOX組與Sham組，每組15只。術后8周分離各組小鼠的血清，測定血清鈣、磷及ALP水平；取各組小鼠的雙側股骨與脊柱，病理切片分析股骨組織形態結構，骨密度儀檢測脊柱骨密度變化。

1.2.2BMSCs的體外培養與檢測 采用全骨髓法培養BMSCs[8]。分離細胞，置于37℃，0.5%CO2培養箱中培養，間隔3 d換液一次。當原代細胞集落處細胞密度達到密集狀態時，用0.25%的胰酶進行消化傳代。取各組第3代BMSCs，計數后調整濃度至4×104個/ml，培養基調整為1%FBS，鋪96孔板，每孔200 μl。每組細胞均設復孔，接種后第0～6天用CCK-8法檢測各組細胞450 nm波長處的吸光值，每次檢測3個復孔。另取各組第3代BMSCs，提取總蛋白，用Western blot檢測PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平變化。

1.2.3質粒構建及細胞轉染 構建pCMV-IL-38及pCMV-GFP質粒。采用脂質體Lipofectamine?2000將構建好的IL-38質粒及GFP質粒轉染至MC3T3-E1細胞，轉染48 h后用流式細胞術檢測MC3T3-E1細胞的凋亡，Western blot檢測PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平變化。

2 結果

2.1患者的基本信息及血清IL-38水平 患者的基本信息與血清IL-38水平如表1所示。骨質疏松患者(研究組)與對照組相比，性別、年齡等基本信息差異均無統計學意義(P>0.05)。ELISA結果顯示，骨質疏松患者血清IL-38濃度顯著低于對照組(P<0.001)。

表1患者基本信息及血清IL-38水平對比

Tab.1ComparisonofbasicdataandserumIL-38levelbetweendifferentgroups

ItemResearchgroup(n=138)Controlgroup(n=120)t/χ2valuePvalueAge(years)60 8±11 358 7±18 31 120 26Male[n(%)]33(23 9)27(22 5)0 070 79SerumIL?38(pg/ml)13 1±11 086 5±13 747 0<0 001

2.2骨質疏松小鼠模型的建立 術后8周野生型與IL-38轉基因OVX小鼠的血鈣和血磷水平均顯著高于Sham組(P<0.05)，ALP水平顯著低于Sham組(P<0.05)。另外，IL-38轉基因OVX小鼠的血鈣和血磷水平均顯著低于野生型OVX小鼠(P<0.05)，ALP則顯著高于野生型OVX小鼠(P<0.05)，見表2。小鼠的股骨病理切片及脊柱骨密度結果如圖1所示，野生型與IL-38轉基因小鼠OVX組均出現組織形態結構的破壞和骨密度下降，并且IL-38轉基因OVX小鼠的骨組織形態結構破壞和骨密度下降情況均較野生型OVX小鼠顯著減輕(P<0.05)。

2.3BMSCs的增殖及PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平檢測 細胞增殖檢測顯示IL-38轉基因小鼠OVX 組BMSCs的體外增殖能力顯著高于Sham組和野生型小鼠OVX組(P<0.05)。Western blot結果顯示，IL-38轉基因小鼠OVX組BMSCs細胞的PI3K、Akt與NFATc1磷酸化水平均顯著低于野生型OVX組(P<0.05)，GSK3β磷酸化水平顯著高于野生型OVX組(P<0.05)，見圖2。

2.4IL-38對MC3T3-E1的影響 如圖3所示，轉染IL-38后MC3T3-E1細胞的增殖能力顯著提高(P<0.05)；細胞凋亡顯著減少(P<0.05)；PI3K、Akt與NFATc1磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)；GSK3β磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。

表2小鼠模型血清學指標(n=15)

Tab.2Serologicaldetectionofmicemodel(n=15)

GroupBloodcalcium(mol/L)Bloodphosphorus(mol/L)ALP(U/L)WildtypeShamgroup2 09±0 052 81±0 1771 33±10 24WildtypeOVXgroup2 44±0 031)3 47±0 181)36 81±9 131)IL?38transgeneShamgroup2 07±0 032 88±0 1677 48±13 92IL?38transgeneOVXgroup2 26±0 021)2)3 01±0 171)2)47 11±7 271)2)

Note：1)Compared with Sham group，P<0.05；2)Compared with OVX group，P<0.05.

圖1 小鼠股骨病理切片及脊柱骨密度比較Fig.1 Comparison of pathological sections of femur and spine bone densityNote: **.P<0.01.

圖2 BMSCs的增殖及PI3K、Akt、GSK3β與NFATc1的磷酸化水平比較Fig.2 Comparison of proliferation,phosphorylation level of PI3K,Akt,GSK3β and NFATc1 of BMSCsNote: **.P<0.01.

圖3 IL-38對小鼠成骨細胞MC3T3-E1的影響Fig.3 Influence of IL-38 on MC3T3-E1Note: **.P<0.01.

3 討論

骨質疏松的主要特征為骨量低下、骨微結構破壞、骨脆性增加、易發生骨折等[1]。在成年脊椎動物的骨代謝過程中，骨形成和骨吸收是影響重建的一對最重要耦聯動態因素，兩個過程持續不斷地交替發生，使得骨骼不斷更新，從而維持骨代謝穩態，因此這兩種細胞功能異常在骨質疏松發病機理中扮演著重要角色[2]。一旦平衡被打破，骨吸收量超過形成量，則會發生骨質疏松，即發生病理性重塑，骨組織微形態結構將發生改變[9]。本次研究結果顯示，骨質疏松組患者的血清IL-38水平顯著低于對照組，提示IL-38的缺失可能在骨質疏松的發生發展中扮演一定的角色。IL-38轉基因OVX小鼠的骨組織形態結構破壞和骨密度下降情況均較野生型OVX小鼠顯著減輕；體外培養的IL-38轉基因OVX小鼠BMSCs的增殖能力顯著高于野生型OVX組；轉染IL-38后MC3T3-E1細胞凋亡顯著減少。這些結果都說明IL-38可能在骨質疏松小鼠模型的發病過程中發揮重要作用。

IL-38是IL-1家族的第10個成員，又被稱為IL-1F10，人的IL-38基因位于2號染色體2q13-14.1[6,7]。IL-38的一般特性與IL-1所有成員接近，廣泛表達于免疫組織(如脾、胸腺、扁桃體等)中，在皮膚和扁桃體B細胞中的表達尤為明顯，在心臟、胎盤等無免疫功能的組織中則表達不高[7,10]。IL-1家族細胞因子廣泛存在于炎性細胞內，對調節所有真核生物的健康與疾病起著不可或缺的作用[11]。Ven de Veerdonk等[6]證明IL-38能與IL-36R特異性結合，高濃度IL-38比相同濃度的IL-36Ra與IL-36R的結合能力更強。IL-38與IL-36受體結合對免疫細胞產生的生物學作用與IL-36Ra和IL-36R受體結合對免疫細胞產生的生物學作用相似，推測IL-38也可能通過抑制IL-36(α、β、γ)與IL-36R的結合而發揮抗炎作用[6]。

PI3K/Akt信號通路是細胞增殖、轉移、黏附和死亡過程的重要調節者[4]。在正常生理條件下，PI3K/Akt信號通路可選擇性的影響成骨細胞和破骨細胞的生理功能，對維持骨組織動態平衡具有重要作用[4,5]。此外，PI3K/Akt信號通路對破骨細胞的存活也是至關重要的[12]。以PI3K/Akt為靶點有可能成為研究開發治療骨質疏松癥的新途徑。破骨細胞的形成過程需要兩個關鍵性因子：RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)[13]。RANKL屬腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，能誘導破骨形成的關鍵轉錄因子(如NF-κB、c-Fos等)的轉錄，是破骨細胞形成的主要調節者[14]。PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路在RANKL引起的破骨細胞形成和分化過程中扮演著非常重要的角色。本次研究結果顯示，IL-38轉基因OVX小鼠BMSCs的PI3K、Akt與NFATc1磷酸化水平均顯著低于野生型OVX組，GSK3β磷酸化水平顯著高于野生型OVX組。MC3T3-E1細胞轉染IL-38后PI3K、Akt與NFATc1的磷酸化水平均顯著降低，GSK3β的磷酸化水平顯著升高。因此，對PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路的調控可能是IL-38抑制骨質疏松的一種潛在機制。

綜上所述，骨質疏松患者的血清IL-38水平顯著降低，IL-38可能通過調控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信號通路促進BMSCs的增殖、抑制成骨細胞的凋亡，從而發揮抑制骨質疏松的作用。

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