奧地利發現與仔豬先天性震顫相關的新型瘟病毒（Linda病毒）

摘譯自Benjamin Lamp，等， Emerging Infectious Diseases. 2017， 23：1176-1179咸 文，梁海英，曾智勇

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

薦語：仔豬先天性震顫可導致仔豬震顫，無法正常吸吮乳汁，常導致斷奶前仔豬死亡率升高，給養豬業造成很大損失，本文介紹了奧地利某豬場暴發仔豬先天性震顫，經檢測發現致病因素為一種新型瘟病病毒種類——Linda病毒。

曾智勇，男，1978年9月生，四川威遠人，博士，貴州大學教授、碩士研究生導師、貴州大學學術骨干，貴州省科技特派員，黑龍江畜牧獸醫雜志編委。主要從事動物傳染病及病原分子生物學相關研究，以規模化豬場主要病毒性疫病為基礎，開展新型疫苗和病原快速檢測方法及試劑盒的研發。同時，長期面向豬場開展豬病毒性疫病的抗體監測和病原的快速檢測以及規模化豬場疾病防控指導，為豬場提供技術支持。

主持國家自然科學基金項目1項，省廳級項目3項；參研貴州省農業科技攻關項目5項，其他各類省廳(局)級項目13項；獲“貴州省科學技術進步獎三等獎”3項。先后發表各類學術論文180余篇，其中SCI論文3篇，一級學報論文12篇，核心期刊90余篇；參編養殖技術叢書3冊，參編專業類編著2冊，參編《畜牧獸醫行政管理學》（國家統編教材）。

2003年在澳大利亞某豬場出現豬的非典型瘟病毒，后被稱為Bungowannah病毒（BV）， 該病毒引起母豬的繁殖障礙，死胎和猝死，由于其明顯的致病性，BV被認為是對全球豬健康事業最大的威脅，但這種病毒或其類似病毒在其他地方從未發現過。最近，一組新型的豬瘟病毒在北美被鑒定，稱之為非典型豬瘟病毒（APPV），隨后在歐洲也檢測到該病毒。有充足的證據表明，APPV是仔豬A-II型先天性震顫（CT A-II）綜合征的致病因子，其特征表現為因腦和脊髓中不同程度的低髓鞘化而引起的全身性震顫。然而，邊界病病毒（BDV），牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）或豬瘟病毒（CSFV）在妊娠晚期感染后，也可導致羊、牛或豬的胎兒腦中出現類似的低髓鞘化。奧地利某農場于2015年1月份暴發了仔豬先天性震顫（CT），造成大量損失，仔豬表現嚴重地橫向震動，常常無法吸吮乳汁，導致斷奶前死亡率升高；CT的發病率從20%到100%不等。該場發生CT疫情后，PSY由原來的25.8降低到僅22.4；病理檢查后證實存在典型的CT A-II病理損傷。

然而，利用基于RT-PCR的APPV特異性TaqMan探針，檢測來自該場的不同樣品，其結果均為陰性。但是應用新的瘟病毒屬通用引物（PPF 5'-GTKATHCAATACCCTGARGC-3'和PPR 5'-GGRTTCCAGGARTACATCA-3'），通過RTPCR從CT仔豬血清樣品擴增，獲得了一定長度的擴增產物，該通用引物也能夠用于檢測CSFV，BVDV-1，BVDV-2，BDV，BV和APPV。該擴增產物測序結果顯示，是一段具有連續性開放閱讀框的未知序列，核苷酸BLAST比對結果顯示未見有相似性序列，但翻譯后的270aa序列卻與不同的瘟病毒相關序列排序一致。在CT仔豬及其同窩仔豬的所有樣本（血清，扁桃體，肺，肝，脾和中樞神經系統材料）中均檢測到病毒RNA。

將CT仔豬血清樣品接種SK-6細胞后，采用RT-PCR能檢測到未知瘟病毒的核酸。為避免與其他瘟病毒混淆，暫時將該致病因子其命名為“Linda”（誘導神經組織損傷導致橫向震顫的致病因子），利用標準引物進行RT-PCR擴增獲得了Linda病毒（LV）的全基因組，并上傳至GenBank（登錄號KY436034），其長度為12 614 bp，具有381 bp的5'-非翻譯區，11 772 bp的開放閱讀框和461 bp的3'-非翻譯區。利用CLC Workbench 7.6對LV進行系統發育分析，發現LV與APPV之間的相似性僅有60%，與BV之間的相似性為68%。LV與BV氨基酸序列相似性為69%，與其他瘟病毒的氨基酸相似性＜54%。LV中含有所有已知的NS3蛋白酶裂解位點；位于典型豬瘟病毒的L/A、BV的L/S位點上的NS4A-NS4B裂解位點，在LV中被定位于L2354/S2355位點處；在LV中，分子內NS3切割位點（L1834/A1835）系保守位點，每種推導的成熟蛋白與BV成熟蛋白匹的配度最好。將Linda病毒（GenBank登錄號KY436034）的核苷酸（圖1）和氨基酸（圖2）序列分別進行遺傳進化樹分析，其均與Bungowannah病毒（登錄號EF100713.2）處在同一進化分支上，同源性較近。而標準瘟病毒BVDV-1（登錄號M31182.1）、BVDV-2（登錄號U18059.1）和BVDV-3（登錄號AB871953.1）處于同一進化分支；CSFV（登錄號X87939.1）和綿羊瘟病毒（登錄號：NC_018713.1）處在同一進化分支上；BDV（登錄號AF037405.1 ）和馴鹿瘟病毒（登錄號AF144618.2）則位于同一進化分支上，上述三個分支共屬于一個較大分支，與LV病毒所屬分支較遠，同源性也較遠。

圖1 核苷酸遺傳進化樹分析

被稱為6A5的BVDV E2特異性抗體對LV感染細胞有很強的反應性。在Western印跡分析中，該抗體可與LV的E1-E2異二聚體（75kDa）以及E2單體（50kDa）反應，但與BVDV-1 E2的反應性更強。利用該抗體，可在體外對LV的增殖進行很好的研究。SK-6 和MDBK細胞在被接種LV后，LV E2抗原信號可在其細胞質中被檢測到，但在SK-6細胞中的E2抗原陽性病灶比MDBK細胞大10倍。在接種的豬原代細胞懸液中，LV感染滴度可大于107TCID50。利用單克隆抗體6A5進行免疫組化分析，可在患CT仔豬的組織學病變區域中檢測到陽性抗原。三叉神經核、小腦神經膠質細胞和腦白質、腎臟腎小管上皮的神經元特異性染色結果證明瘟病毒可以穿過血腦屏障。但是在胎兒發育過程中，瘟病毒誘導鞘內脫髓鞘的機制仍不清楚。

圖2 氨基酸遺傳進化分析

通過在CT仔豬脊髓的整個白質中觀察到嚴重的鞘內脫髓鞘病變，在腦中檢測到瘟病毒抗原，表明瘟病毒感染和病變之間存在因果關系。與幾乎不感染培養細胞的APPV相比，LV與BV類似，可以很容易地在豬細胞系上增殖而不需要適應過程，因而認為LV可能與BV有共同的祖先。大約10年前，BV就在全球范圍內得到了廣泛的關注，但目前在澳大利亞境外從未被發現過。由于BV廣泛的細胞嗜性，進而提出了關于該病毒系跨種感染豬的假說。E2特異性單克隆抗體6A5的交叉反應鑒別實驗結果表明，其與各瘟病毒的蛋白存在交叉反應性，這可能會干擾CSFV的血清學檢測。LV在歐洲的流行病學情況，其對實驗動物的毒力評估，仍需要進一步的調查和研究。