豬瘟、豬藍耳病毒和沙門氏菌混合感染的實驗室診斷

于國偉，倪宏波

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319）

豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種具有高度接觸性，急性，熱性，多數呈地方流行性的傳染病[1]。主要表現為仔豬呼吸困難、氣喘等呼吸系統癥狀和高致死率，主要傳播途徑為空氣和接觸等水平傳播，也可通過胎盤和交配等垂直傳播。豬瘟(CSF)又稱豬霍亂或爛腸瘟是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性、急性或慢性、發熱性和致死性傳染病。其主要臨床表現為母豬發生繁殖障礙性疾病，不孕不育，流產，死胎等癥狀。該病不僅引起母豬繁殖障礙、新生仔豬先天感染以至死亡，還可引起免疫耐受并出現免疫失敗的現象。目前，該病在包括中國在內的亞洲、非洲、拉丁美洲、歐洲東部等的養豬國家和地區都有不同程度的發生與流行，給養豬業的繁育和經濟帶來了嚴重損害[2，3]。豬沙門氏菌病(swine salmonellosis)又名仔豬副傷寒(Piglet paratyphoid)，是由沙門氏菌屬細菌引起的仔豬的一種傳染病，主要表現為敗血癥和壞死性腸炎，有時發生腦炎、腦膜炎、卡他性或干酪性肺炎[4]。該病在臨床上分為急性和慢性兩型，一般呈散發或地方性流行，一年四季均可發生，但以春、冬和潮濕多雨的秋季發生居多。2017年8月，實驗室接診大慶市某豬場送檢病例，經實驗室診斷確診為豬瘟、豬藍耳病毒和沙門氏菌的混合感染。現報告如下：

1 發病情況

黑龍江省大慶市某豬場存欄300頭豬，2017年8月該豬場仔豬突然發病，臨床表現為發熱，體溫升高至41～42 ℃，仔豬腹瀉排有黃色或灰綠色稀便，呼吸困難，偶有氣喘，體表皮膚發紺并有針狀出血點，精神萎靡，食欲廢絕，仔豬發病率約為45%，死亡率約為55%，病程為2～5 d。母豬食欲下降，精神沉郁，個別出現流產與死胎等癥狀。

2 剖檢變化

眼觀，病豬全身皮膚發紺，腹部及臀部發紫，耳尖發紫，眼結膜水腫，腿部和背部有針尖大小出血點，被毛粗亂無光澤，腹部有不規則的隆起丘疹。剖檢后，取出腹股溝淋巴結發現其腫大并充血，腸壁增厚充血并有潰瘍灶，腸系膜淋巴結腫大充血（見圖1），腹腔里肝臟水腫，脾臟腫大表面有出血點并伴有少量壞死灶（見圖2），回盲口處有扣狀腫。胸腔中肺臟明顯水腫且嚴重充血，肺膈葉有輕度卡他性炎癥（見圖3），通過流行病學調查、臨床癥狀和病理剖檢臟器變化初步懷疑為豬瘟、豬藍耳病毒和沙門氏菌混合感染，但還需進一步通過實驗室診斷來確診。

圖1 腸壁增厚充血，腸系膜淋結腫大

圖2 脾臟水腫且有白色壞死灶

圖3 肺臟腫大充血

3 實驗室診斷

3.1 細菌學檢測

無菌采集病死豬的腸、肺臟用平板劃線法涂布于瓊脂培養基中，37 ℃培養24 h，形成灰白色菌落，挑取菌落于SS瓊脂培養基中，37 ℃培養24 h，觀察到中間黑色外部透明的圓形菌落（見圖4），挑取其菌落進行革蘭氏染色，鏡檢時可見兩端鈍圓的陰性桿菌（見圖5）。

圖4 SS瓊脂培養基上長出中間黑色外周透明的菌落

圖5 兩端鈍圓的陰性桿菌（10x10）

3.2 生化鑒定

細菌純培養后，分別接種于硫化氫、苯丙氨酸、鳥氨酸、甲基紅、尿素、賴氨酸、枸椽酸鹽、靛基質、葡萄糖等生化培養基，37 ℃培養24 h，觀察其生化反應特性，結果為該菌株可使硫化氫變黑，能分解葡萄糖但產酸不產氣，能使鳥氨酸和賴氨酸變紫但不能發酵尿素，符合《常見細菌系統鑒定手冊》中沙門氏菌的特征，因此可判定該菌株為沙門氏菌（見表1）。

3.3 藥敏試驗

挑取單菌落溶于生理鹽水中，然后均勻涂布于血瓊脂培養基中，貼上四環素、恩諾沙星、頭孢唑啉、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、克林霉素、林可霉素等藥敏片，37 ℃培養24 h，通過測量抑菌環判斷其耐藥性，結果表明該細菌對恩諾沙星、慶大霉素和鏈霉素高度敏感；對卡那霉素、克林霉素中度敏感；對四環素、頭孢唑啉和林可霉素有較強的耐藥性（見表2）。

3.4 PCR檢測

用TIANamp Virus DNA/RNA Kit 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病料組織的DNA和RNA，用豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬藍耳病毒、豬鏈球菌、豬沙門氏菌、豬流行性腹瀉病毒等特異性引物進行PCR擴增檢測，這些特異性引物參照GenBank公布的基因序列進行設計而合成（見表3）。結果顯示第1泳道在599 bp左右處有一條條帶，與豬瘟病毒引物的目的片段大小相符；第2泳道在372 bp左右處有一條條帶，與豬藍耳病毒引物的目的片段大小相符；在第3泳道307 bp左右處有一條條帶，與豬沙門氏菌引物的目的片段相一致（見圖6）。再結合該病例的發病情況、臨床表現、剖檢后組織器官的病理變化以及相應的實驗室診斷可確診為該病例是由豬藍耳病毒、豬瘟和豬沙門氏菌的混合感染。

圖6 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

表1 生化鑒定結果

表2 藥敏試驗結果

表3 引物列表

4 討論

結合發病情況、剖檢后組織器官的病理變化、臨床表現以及實驗室診斷等方面可確診大慶市某豬場送檢的病豬為豬藍耳、豬瘟病毒和豬沙門氏菌的混合感染。雖然該豬場已經免疫接種過豬瘟及豬藍耳病疫苗，但體內產生的抗體不足以抵抗病毒的侵襲，恰好大慶地區在8月初頻繁下雨導致空氣環境悶熱潮濕，在這種應激條件的刺激下很容易使豬群發生應激反應，致使其免疫抵抗力降低從而繼發感染沙門氏菌。因此，應盡量改善豬群的生活環境，并制定合理的免疫程序，避免引起豬群細菌性繼發感染。

1）目前，豬藍耳病毒和豬瘟病毒尚無特效藥可供治療，因此預防是關鍵。防治原則是盡力切斷或減少傳染源并提高敏感動物的抗病能力，防止并發和繼發感染；嚴格控制生豬來源，避免外毒帶入；堅持自繁自養。加強飼養管理， 搞好豬圈的清潔衛生；減少飼養密度，保持良好通風，做到冬暖夏涼；調整日糧，多添加富含維生素、礦物質的飼料，以保持氨基酸平衡[5]。同時，該豬場可采取全進全出方式，盡量避免不同豬群間的接觸在最大程度上降低感染。

2）目前，防治豬沙門氏菌病的疫苗種類較多，但最好使用當地或者本群分離得到的菌株制成的單價滅活疫苗，具有最好的免疫效果，而一般的單價滅活苗和多價滅活疫苗效果較差[6]。本實驗室通過藥敏試驗確定了慶大霉素、鏈霉素、恩諾沙星對該株沙門氏菌具有良好的滅菌抑制作用，建議采用以上藥物治療豬群。

3）定期用消毒水對豬場進行噴霧消毒，降低環境中的細菌量。對病死豬要嚴格執行無害化處理，而對病豬的排泄物及污染的飼料、飲水、用具、食槽和圈舍等，要用2%～4%火堿溶液或10%～20%石灰乳進行徹底消毒[7]。同時對運輸車輛也要做好消毒工作，防止外來病毒入侵。

[1] BILODEAU R， ARCHAMBAULT D，VEZINA S A， et al. Persistence of porcine reproduetive and respiratory syndrome virus in fection in a swine operation[J]. Can J Vet Res，1994，58(4)： 291-298.

[2] PEREDA A J，GREISER- WILKE I，SCHMITT B， et al. Phylogenetic analysis of classical swine fever virus(CSFV)field isolates from outbreaks in South and central America [J]. Virus Res， 2005， 110(1/2)： 111- 118.

[3] WU C M，HSUAN S L，CHEN Z W，et， al. Expression and immunological studius of classical swine fever virus glycoprotein E2 in the bi-cistronic baculovirus/larvae expression system[J].Biosci Biotechnol Biochem，2010， 74(7)： 1343- 1349.

[4] Marzia Mancin， Lisa Barco， Cristina Saccardin， et al. Proposed statistical analysis to evaluate qualitative proficiency testing of Salmonella serotyping[J]. Accreditation and Quality Assurance， 2015， 20(4)： 305-310.

[5] 吳彩霞， 李和平. 豬藍耳病的綜合診斷與防治新技術研究進展[J]. 青海畜牧獸醫雜志， 2015， 45(2)：54-55.

[6] 張娜. 豬沙門氏菌病的流行病學、臨床表現、診斷和防控[J]. 現代畜牧科技，2017 (4)：86.

[7] 周秀芹. 豬沙門氏菌病的診斷與防控措施[J]. 國外畜牧學(豬與禽)， 2016，36(9)： 84-85.