由中鏈脂肪酸與植物精油為主要成分組成的復合型酸化劑抑菌性能的研究

祁姣姣，朱劍鋒，周海泳，胡學生，王 創，劉紫芊，胡文鋒，*

（1. 生物源生物技術（深圳）股份有限公司，深圳 518118；2.華南農業大學，廣州 510642）

抗生素在動物生產應用中長期大量濫用，可造成動物機體免疫力下降[1]，在畜產品和環境中造成殘留[2]，甚至導致人畜共患耐藥細菌的產生等嚴重后果，嚴重地危害著人類健康[3]。2016年7月26日的我國農業部第2428號公告：決定停止硫酸黏菌素用于動物促生長[4]。在飼料中限制甚至禁用抗生素是消費者的要求，是全球大趨勢，為適應這一需求，積極開發可替代抗生素的綠色飼料添加劑具有積極的意義。中鏈脂肪酸（mediumchain fatty acids ， MCFAs）包括己酸（C6）、辛酸（C8）、癸酸（C10）和月桂酸（C12），其在動物體內因其獨特的消化、吸收、轉運和氧化等特點，能迅速有效地為幼小動物提供能量，具有顯著的抗菌和促生長等功效[5]。另外，天然植物精油具有顯著的抑菌活性、廣譜抗菌性以及安全、易降解等特點。

目前大量學者對肉桂醛、百里香酚、丁香酚、香芹酚等植物精油主要成分的抑菌性能、相互抑菌協同作用以及其抑菌機制進行探究。發現其具有高抑菌活性，但是將其和中鏈脂肪酸配合作為高效的復合型飼料酸化劑未見報道。為此，本試驗以大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等3種菌為指示菌，利用正交優化實驗，得到抑菌性能最優的復合型酸化劑，并對其抑菌性能進行探討。試驗旨在為探究替代抗生素促生長劑的高效的復合型酸化劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

己酸（C6， 80%）、辛酸（C8， 80%）：河南雅大食品有限公司 ；癸酸（C10， 分析純）、月桂酸（C12， 分析純）：成都化夏化學試劑有限公司；肉桂醛（99%）：江西雪松天然藥用油有限公司提供；吐溫-80：廣州化學試劑廠；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；香芹酚（分析純）：廣州日化化工有限公司；百里香酚（分析純）：吉安市青原區東方天然香料油提煉廠；丁香酚（分析純）：日本東京化成工業株式會社。

1.1.2 培養基及菌種

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由華南農業大學食品學院應用微生物教研室提供。

牛肉膏蛋白胨液體培養基：取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加水1 000 mL加熱，調節pH至7.0-7.2，分裝到三角瓶中。密封，121 ℃，0.1 mpa滅菌20 min。如需配置固體培養基則加入2%瓊脂，操作同上。

1.1.3 主要儀器設備

LS-B75C-I立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫療設備有限公司；HK-C2S型單人雙面垂直潔凈工作臺，廣東環凱微生物科技有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；酶標儀，PE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌劑溶液的配制

稱取一定量的抗菌劑分別溶于0.5%（v/v）無水乙醇，然后加入含0.5%（w/v）吐溫-80的無菌液體，邊倒邊攪拌，震蕩均勻。其中乙醇含量0.5%，吐溫-80含量0.5%，在該濃度下，二者通過預實驗證明均無抑菌性[6]。

1.2.2 復合型抗菌劑配方的初步篩選

根據李成應等篩選中藥制劑的方法，略有改動[7]。按L8（27）正交表(表1)和表2的劑量水平添加配置成相應的8種抗菌劑溶液的母液，調節母液的濃度為2 000 μg/mL。將復配好的8種抗菌劑的母液，分別加入到無菌的96孔聚苯乙烯板中，其中第2至第12孔每孔加入100 μL無菌牛肉膏蛋白胨液體培養基，第1、2孔加100 μL抗菌劑液，混合均勻，從第2孔中吸取100 μL到第3孔，以此類推，第11孔吸取100 μL棄掉，然后分別在第1到12孔加入100 μL105CFU/mL菌液，此時各孔對應的組合抗菌劑配方的濃度依次為1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.6 μg/mL、7.8 μg/mL、3.9 μg/mL等，將96孔板密封后置37 ℃恒溫培養箱中，培養24 h后測定OD600nm值。重復3次，取平均值，選取適當組合抗菌劑配方的濃度所對應的OD600nm值，進行極差分析。同時設置空白對照和抗生素對照。

1.2.3 復合型抗菌劑配方的優化

根據1.2.2的初篩結果，采用正交表L25（56）組合(表3)，進一步做抗菌劑的優化組合探究。各抗菌劑劑量水平設置見表4，方法同1.2.2。培養一定時間，測定OD600nm值。同時設置空白對照和抗生素對照組。重復3次，取平均值，選取適當抗菌劑組合的濃度所對應的OD600nm值，進行極差分析。劑量優化后的最優組合為抗菌基礎配方。

1.2.4 復合型抗菌劑最優配方的驗證將直觀最優組合和正交實驗優化的最優組合按表4的劑量水平配置成相應母液，調節母液的濃度為2 000 μg/mL。按照1.2.2方法，進行驗證實驗。

1.3 復合型酸化劑抑菌性能研究

1.3.1 復合型酸化劑抑菌敏感性測定

采用打孔法。吸取100 μL 107CFU/mL指示菌的菌懸液于營養瓊脂培養皿中，涂布均勻。利用8 mm無菌打孔器打孔。然后在每個孔中分別加入100 μL的對應濃度（0.5%）的復合型酸化劑溶液。于37 ℃恒溫培養箱，培養24 h，取出，測定其抑菌圈大小。同時做空白對照。

1.3.2 復合型酸化劑最低抑菌濃度（MIC）測定

采用瓊脂平板稀釋法：將不同劑量的復合型酸化劑液10 mL，加入50 ℃左右的10 mL牛肉膏蛋白胨固體培養基中，震蕩均勻，迅速傾倒平板，制成含不同遞減濃度的試劑平板。用無菌接種器，接種指示菌，最終每點菌數約為104CFU，形成直徑為5～8 mm的菌斑。將平板置于37 ℃恒溫培養箱中，培養24 h，觀察。以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低樣品濃度為MIC。同時做抗生素和陰性對照。實驗重復3次

1.3.3 最優復合型酸化劑熱穩定性研究

綜合考慮正交實驗的直觀和優化結果分析以及抑菌敏感性、MIC的比較，選定最優復合型酸化劑組合做以下探究。將最優組合分別于60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴，121℃濕熱條件下處理15 min后[8]，然后分別再加入100 μL菌液，使最終菌液的濃度為105CFU/mL，試劑的濃度為250 μg/mL。然后置于37 ℃培養箱中培養24 h，測定OD600nm值。同時做不加抗菌劑的陰性對照和空白對照，實驗重復3次，觀察最優抗菌劑組合在熱環境中對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌變化規律。

表1 L8（27）正交表

表2 各抗菌劑量水平設置

表3 L25（56）正交表

1.3.4 最優復合型酸化劑抑菌時效的測定

將最優組合配置成濃度為0.5%的復合液，取100 μL加入到已涂布菌液的平板中的孔內，分別于24、48、72、144、216 h，觀察并測定抑菌圈直徑。

1.3.5 最優復合型酸化劑在人工模擬胃、腸液環境中抑菌效能評價

1）最優復合型酸化劑在人工模擬胃液環境中的抑菌特性

在人工胃液環境中分別加入最優組合溶液和指示菌液，使指示菌最終濃度是105CFU/mL，最優組合溶液的最終濃度為500 μg/mL，37 ℃，90 r/min[9]處理4 h，然后采用十倍稀釋法涂布計數[9]。同時做指示菌純培養4 h后的活菌計數，然后計算殺菌率。按上述同樣操作，測定指示菌在非人工胃液的配方試劑環境中（即pH7.0，用生理鹽水配置的最優組合配方液）的殺菌率，并進行比較。

殺菌率的計算公式如下：

2）最優復合型酸化劑在人工模擬腸液環境中的抑菌特性

在人工腸液環境中，分別加入最優組合和指示菌，指示菌最終濃度是105CFU/mL，最優組合溶液的最終濃度為500 μg/mL，37 ℃，120 r/min處理4 h，然后十倍稀釋法涂布計數，同時做指示菌純培養4 h后的活菌數，然后計算殺菌率[9]。同時按上述同樣操作，測定在非人工腸液的配方試劑環境中（pH7.0，用生理鹽水配置的最優組合配方）指示菌的殺菌率，并進行比較，公式如上所示。

1.3.6 統計與分析

所有實驗重復三次，數據結果以平均值（mean）±標準差（SD）表示。數據圖、表由Excel2003軟件完成。

3 結果與分析

3.1.1 復合型酸化劑配方初步篩選結果

表4 優選因素劑量水平設置

表5 各組合方案抗3種指示菌作用正交實驗結果

表6 各組合配方抗3種指示菌正交實驗結果

表5可知，抗大腸桿菌的正交實驗結果表明，主次因素依次為：肉桂醛＞己酸＞辛酸＞香芹酚＞癸酸＞百里香酚＞丁香酚；抗沙門氏菌的正交實驗結果表明，主次因素依次為：肉桂醛＞己酸＞辛酸＞香芹酚＞癸酸＞丁香酚＞百里香酚；抗金黃色葡萄球菌正交實驗結果表明，主次因素依次為：肉桂醛＞癸酸＞香芹酚＞丁香酚＞百里香酚＞己酸＞辛酸。

綜合考慮，優化組合肉桂醛1、香芹酚1、癸酸1、辛酸1、己酸1、百里香酚2、丁香酚1。即因素肉桂醛、香芹酚、癸酸、辛酸、己酸、丁香酚均取1水平，因素6取2水平。該組合能同時較優地抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

3.1.2 復合型酸化劑配方的確定

由表6可知，對大腸桿菌抑菌的直觀分析最優組合號為4、7、8、11、21、22、25；對沙門氏菌抑菌的直觀分析最優組合號為8、11、18、22；對金黃色葡萄球菌的直觀分析最優組合號為8、21。由表6和表7可知，對大腸桿菌，影響其抑菌作用的主次因素依次為：肉桂醛＞辛酸＞丁香酚＞己酸＞癸酸＞香芹酚。其中肉桂醛對其具有顯著性影響（P＜0.05）。最優組合為：2辛酸，1香芹酚，4癸酸，5肉桂醛，（3、4、2）丁香酚，1己酸；對沙門氏菌，影響其抑菌作用的主次因素依次為：肉桂醛＞癸酸＞丁香酚＞香芹酚＞辛酸＞己酸。其中肉桂醛、癸酸、丁香酚對其具有顯著性影響（P＜0.05）。最優組合為：3（2、4）辛酸，3（1、2）香芹酚，1（2）癸酸，5肉桂醛，1（2）丁香酚，2（5、1）己酸；對金黃色葡萄球菌，影響其抑菌作用的主次因素依次為：己酸＞肉桂醛＞丁香酚＞癸酸＞香芹酚＞辛酸。其中己酸、肉桂醛、丁香酚對其具有顯著性影響（P＜0.05）。最優組合為：4（3、5）辛酸，1香芹酚，5癸酸，5肉桂醛，（2、3、1）丁香酚，2己酸。

以上對表6與表7分析可知，直觀分析能同時抗三種指示菌的最優組合號為8，其次為11、22，最后為19。綜合分析能同時抗三種指示菌的優化組合為0：2辛酸、1香芹酚、1癸酸、5肉桂醛、2丁香酚、2己酸

表7 各組合配方抗3種指示菌正交實驗方差分析

表8 正交驗證實驗結果

表9 復合型酸化劑對指示菌抑菌圈測定結果

表10 復合型酸化劑對指示菌的MIC

3.1.3 優化配方結果驗證

由表8可知，濃度為250 μg/mL時，對沙門氏菌和大腸桿菌，0號組合較8號組合抑制效果好，特別是對沙門氏菌的抑制作用，0號組合明顯強。然而在抑制金黃色葡萄球菌時，0號組合較8號組合稍弱。這可能是因為，在選擇對三種指示菌同時具有抑制作用的最優組合的因素時，是經過綜合評價并優先選擇對革蘭氏陰性菌具有很好抑制作用的結果。

3.2 復合型酸化劑抑菌性能測定結果

3.2.1 復合型酸化劑抑菌敏感性測定結果

表9可知，這5種組合對3種指示菌均具有不錯的抑制效果，在濃度為0.5%時，8號組合對金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大為31.49 mm，其次為0號組合。就大腸桿菌和沙門氏菌而言，0號組合較8號組合更優，其次為8號組合。

3.2.2 復合型酸化劑最低抑菌濃度測定結果

由表10可知：各抑菌組合對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌3種指示菌的MIC。可以發現，正交優化最優組合配方0號和直觀最優組合配方8號，以及11、19、22號組合，對3種指示菌的MIC值都明顯高于硫酸新霉素、黃霉素的MIC值。即便如此，該組合仍具有一定的現實意義，比如0號組合的抑菌性良好，且由中鏈脂肪酸和植物精油構成，在兼具抑菌性能的同時，對動物可以產生一定的誘食性，且其安全、無毒。

3.2.3 優化組合復合型酸化劑熱穩定性研究結果

如圖1所示，隨著處理溫度的上升，其對3種指示菌的抑菌性能均為先上升后下降。具體為，對于大腸桿菌，在4（60 ℃）其具有最佳抑菌效果；在5（100 ℃）和6（121 ℃）中，隨著處理溫度的升高，其對大腸桿菌的抑菌效果降低，特別是處理6（121 ℃），相對于1（陰性對照），其經121℃濕熱處理后，基本失去對大腸桿菌的抑制作用。對于沙門氏菌，其經3（60 ℃）處理后對沙門氏菌的抑菌效果增加；在4（80 ℃）、5（100 ℃）、6（121 ℃）中，隨著處理溫度的升高，其對沙門氏菌的抑菌效果降低。對金黃色葡萄球菌，最優組合配方經3（60 ℃）處理后，其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果顯著增加；在4（80 ℃）、5（100 ℃）、6（121 ℃）中，相對于2（常溫），隨著處理溫度的升高，其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果降低。特別是最優組合配方經6（121 ℃）處理后，相對于陰性對照，此時，其對金黃色葡萄球菌幾乎無抑制作用。

圖1 溫度對最優復合型酸化劑抑菌的影響

隨著處理溫度的升高，最優組合配方對指示菌的抑菌效果先增加，這可能與體系構成的復雜度有關(成分復雜、微乳化環境)，適當加熱處理后，體系結構可能發生有利于配方溶液抑制指示菌方向的變化。隨后，隨著處理溫度的繼續升高，其對指示菌的抑菌效果降低，甚至是消失，這可能是因為隨著進一步的高溫處理后，復配液中抗菌劑成分遭到破壞或者揮發。綜合最優組合配方隨著溫度的變化對三種指示菌抑菌的變化規律推測，其經60 ℃密封加熱處理，有利于最優組合配方對3種指示菌同時發揮較好的抑菌作用。

3.2.4 最優復合型酸化劑抑菌時間的測定

該最優組合復配液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈在長時間培養中變化不大。分別從24 h測得的27.36 mm變至25.22 mm，17.45 mm變至14.04 mm，16.12 mm變至14.57 mm。其抑菌效果能在較長時間內發揮作用，指示菌不易回長。

3.2.5 最優復合型酸化劑在模擬胃、腸液環境中抑菌效能評價

如表11所示，最優組合配方在模擬胃液環境中對指示菌作用4 h后，仍能將金黃色葡萄球菌和沙門氏菌全部殺死，而其在此環境中對大腸桿菌的抑菌效果有所下降，但是其殺菌率仍能達到95.6%，仍具有較好的抑菌性能。其在人工模擬腸液環境中對指示菌作用4 h后，仍能將金黃色葡萄球菌全部殺死，而其在此環境中對沙門氏菌、大腸桿菌的抑菌能力有所下降，但是其殺菌率仍分別能達到93.8%、98.24%，仍具有較好的抑菌性能。

4 結論

1)通過對樣品的篩選，利用正交實驗優化，篩選出抑菌劑的最佳優化配比為0號組合，即辛酸∶香芹酚∶癸酸∶肉桂醛∶丁香酚∶己酸=2∶1∶1∶5∶2∶2，直觀最優配比組合為8號組合，即辛酸∶香芹酚∶癸酸∶肉桂醛∶丁香酚∶己酸=2∶3∶4∶5∶1∶2。

表11 最優組合配方在人工模擬胃液、人工模擬腸液環境中抑菌效能評價%

2)0號和8號組合對3種指示菌均有很好的抑制作用。最優配方0號組合，隨著溫度的升高，其抑菌能力先上升后下降。其能在較長時間（216 h）內發揮抑菌作用，指示菌不易回長。其在模擬胃、腸液環境中仍具有很強的抑菌能力，在模擬胃液環境中，其可以100%殺滅金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，對大腸桿菌的殺菌率為95.6%；其在模擬腸液環境中對三者的殺菌率依次為，100%、93.8%、98.24%等。

[1] 李翠枝， 劉艷輝， 郭軍. 抗生素和其他獸藥殘留的危害[J]. 中國乳品工業，2004，32(10)：17-22.

[2] 王蘭. 抗生素污染現狀及對環境微生態的影響[J]. 藥物生物技術， 2006，13(2)：144-148.

[3] RHODES G， HUYS G， SWINGS J，et al. Distribution of oxytetracycline resistance plasmids between aeromonads in hospital and aquaculture environments： implication of Tn1721 in dissemination of the tetracycline resistance determinant tet A.[J]. Applied and environmental microbiology， 2000， 66(9)：3883.

[4] 佚名. 農業部：停止硫酸黏菌素用于動物促生長[J]. 現代畜牧獸醫，2016(8)：63-63.

[5] 楊金堂， 黃克和， 王建林，等. 中鏈脂肪酸在畜牧業上應用的研究進展[J].畜牧與獸醫， 2009， 41(5)：100-105.

[6] 張希， 楊明， 宋飛，等. 脂肪酸及其衍生物的抑菌活性[J]. 浙江大學學報(農業與生命科學版)， 2013， 39(2)：155-160.

[7] 李成應. 治療奶牛乳房炎的復方中藥制劑的開發研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學， 2008.

[8] 熊素英. 石榴皮抑菌液的制備及抑菌特性研究[D].西安：西北農林科技大學，2007.

[9] 張媛媛， 陽艷林， 黃廣明，等. 不同益生菌體外模擬胃腸道環境耐受性的比較研究[J]. 飼料工業， 2013，34(17)：43-45.