口服N-乙酰半胱氨酸對PM2.5染毒大鼠肺損傷的作用

空氣中粒徑在10 μm以下的顆粒物均可被吸入并沉積在呼吸系統中,其中粒徑≤2.5μm的顆粒物(particulate matter 2.5,PM2.5)富集多種重金屬、有機污染物、酸性氧化物等,且是病原微生物的載體,吸入后可進入呼吸道深部,對人體的毒性和危害性更大[1-4]。近年來,我國大部分地區空氣污染嚴重,呼吸道疾病的患病率呈逐年上升趨勢,其中PM2.5被認為是重要的致病物質。研究表明:氧化應激損傷是PM2.5 損傷呼吸系統的重要機制之一[5],而N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)具有抗氧化應激作用,但對PM2.5所致肺損傷是否有效,及治療劑量與效果是否具有量效關系尚不明確。為此,本課題制備PM2.5染毒SD大鼠肺損傷動物模型,并給予不同劑量NAC口服治療,檢測氧化應激、肺損傷程度及炎癥反應等指標,探討NAC對PM2.5染毒SD大鼠肺損傷的治療作用,為NAC治療PM2.5相關肺損傷提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成年健康Sprague-Draw(SD)大鼠50只，均為雄性，體質量203～219 g，平均(211.8±7.8)g，購入后于室溫22 ℃～28 ℃飼養，供標準口糧，自由飲食，飲用水為無菌飲用水，日照12 h/d，觀察l周后實驗。

1.2 PM2.5的采集及混懸液制備 應用嶗應2030型中流量智能TSP采樣器于2016年6月1日至10月30日在市中心采樣,將顆粒物采集在直徑9 cm的玻璃纖維濾膜上,采樣結束后,將玻璃纖維濾膜剪碎放入50 ml超純水中,超聲震蕩15 min洗脫,吸取洗脫液后再次加入50 ml超純水繼續超聲震蕩15 min,將兩次洗脫液合并于錐形瓶中,經多層無菌紗布過濾后用低溫離心機將洗脫液于4℃、10 000 r/min離心3次,每次20 min。棄上清液，將底層顆粒物進行真空冷凍干燥后合并顆粒物,將其低溫冰箱保存。用生理鹽水制備成濃度為40 mg/ml的顆粒物混懸液,超聲振蕩5 min使顆粒物混勻并滅菌。

1.3 實驗方法 成年SD大鼠50只,采用隨機數字表法分為5組,每組10只,采用氣道滴入法制備動物模型?？瞻捉M經氣道滴入生理鹽水,對照組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組經氣道滴入PM2.5滅菌懸液,均制作為PM2.5 染毒肺損傷動物模型。對照組不給予NAC干預治療,治療組分別給予口服低、中、高劑量NAC治療。以上動物實驗過程經動物倫理委員會評議同意實施。

1.3.1 PM2.5染毒肺損傷大鼠模型的制備:模型制備前大鼠自由進水,禁食12 h。稱重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,將大鼠仰臥固定于操作臺上,剪去頸毛消毒頸部皮膚,于頸部中線下段做1 cm切口,鈍性分離皮下組織和肌肉,暴露氣管,灌注針頭于氣管環狀軟骨間插入,按1 ml/kg劑量注入PM2.5混懸液,注射后將大鼠直立旋轉數次,使PM2.5混懸液均勻分布于大鼠肺部,待大鼠呼吸節奏平穩后縫合切口。10只空白組按1 ml/kg劑量注射生理鹽水,均給予16萬U青霉素注射3 d預防感染。

1.3.2 PM2.5 染毒肺損傷大鼠NAC治療方法:低劑量組給予NAC 300 mg/(kg·bw)口服,中劑量組給予NAC 600 mg/(kg·bw)口服,高劑量組給予NAC 1200 mg/(kg·bw)口服,連續治療10 d。

1.4 檢測方法 各組大鼠均于第10天時腹腔注射10%水合氯醛麻醉,分離出氣管,行氣管插管并固定,收集股動脈血送檢。開胸完整切除右肺制成肺病理標本。左肺用4℃無菌生理鹽水經氣管插管灌洗,回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)檢測谷胱甘肽(glutathione,GSH)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量。GSH采用GSH試劑盒檢測(試劑盒為美國Cayman Chemical公司生產),LDH采用日立7170A全自動生化分析儀及專用試劑盒檢測,將血漿和BALF樣品所測得A值代入標準曲線,計算濃度。肺組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達采用免疫組化法,隨機選取肺組織切片的5個視野,應用Meta Morph軟件分析陽性細胞的光強度,光強度越高,則TNF-α蛋白表達越多。采用ELISA法檢測肺組織勻漿中白細胞介素-10(interleukin 10,IL-10)和IL-18含量。IL-10、IL-18試劑盒均購自北京尚柏生物醫學技術有限公司。

2 結果

2.1 口服不同劑量NAC對PM2.5染毒大鼠氧化應激及肺損傷治療作用 對照組與各治療組大鼠血漿和BALF中GSH水平均低于空白組,LDH水平高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05)。各治療組大鼠GSH水平均高于對照組,LDH水平低于對照組(P<0.05)。低、中、高3個治療組大鼠血漿和BALF中GSH和LDH水平差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血漿和BALF中LDH、GSH水平比較

注：與空白組比較,*P<0.05;與對照組比較,△P<0.05;與低劑量組比較,▲P<0.05;與中劑量組比較,#P<0.05

2.2 不同劑量NAC口服對PM2.5染毒大鼠炎癥反應的影響 對照組與各治療組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10、IL-18含量均高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05)。各治療組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10、IL-18含量均低于對照組(P<0.05)。高劑量組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10、IL-18含量低于低劑量組(P<0.05)。低劑量組與中劑量組、高劑量組與中劑量組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-10、IL-18含量比較

注：與空白組比較,*P<0.05；與對照組比較,△P<0.05；與低劑量組比較,▲P<0.05

3 討論

3.1 NAC對炎癥反應的作用 TNF-α是重要的前炎性細胞因子,異常升高的TNF-α可通過以下途徑或機制引起肺損傷。(1)與肺組織TNF-α受體結合,使溶酶體受損外泄，直接損傷肺組織及毛細血管等;(2)刺激血管內皮細胞,上調肺血管內皮細胞間黏附分子-1表達,增加毛細血管通透性,致白細胞等向炎癥部位遷移,引起肺損傷[6-7];(3)TNF-α可誘導巨噬細胞和內皮細胞合成、釋放IL-18等前炎性細胞因子,促進炎癥反應,并進一步放大炎癥信號,產生級聯放大作用,加重肺損傷[8]。IL-18也是一種強烈的細胞免疫刺激因子,炎癥反應時IL-18可造成組織損傷。IL-10是由單核巨噬細胞產生的一種抗炎性細胞因子,相關研究發現,機體在急性炎癥反應出現時,多種細胞炎癥因子,包括TNF-α、IL-18、IL-10等表達升高,可在24～72 h達峰值。本研究結果顯示,對照組肺組織TNF-α、IL-10、IL-18含量高于空白組,差異有統計學意義。說明PM2.5可導致肺部炎癥,刺激免疫系統產生大量的促炎因子和抗炎因子。 NAC治療后,肺組織TNF-α、IL-10、IL-18含量均較對照組明顯降低,可能是NAC治療后炎癥反應減輕,其誘導的淋巴細胞、單核巨噬細胞分泌的IL-10減少。

3.3 NAC對肺損傷的作用 LDH是一種糖酵解酶,由2種亞基M和H組成,分布于所有組織器官中,而且其分布組織特異性明顯,是臨床診斷組織器官損傷的特異性指標之一。正常生理狀態新陳代謝下,血漿中LDH含量處于正常值范圍,在肝臟和肌肉組織中以LDH5為主,在心臟組織中以LDH1為主,在肺組織中以LDH3為主。一旦組織細胞非正常大量損傷時,會有大量LDH分子漏出[11],導致血漿LDH水平升高。PM2.5染毒大鼠發生肺損傷時,肺間質和實質細胞產生大量LDH3,并釋放至血中,導致血漿和BALF中LDH水平升高。檢測血漿和BALF中LDH活性可判斷肺組織損傷程度。本研究結果顯示,對照組LDH活性明顯高于空白組,差異有統計學意義,提示PM2.5可致大鼠肺損傷。NAC治療后LDH活性均低于對照組,且高劑量、中劑量、低劑量治療組間GSH水平從低到高排列,差異有統計學意義,提示NAC治療可減輕肺損傷。

綜上所述,PM2.5對呼吸系統有多種損傷作用,氧化應激損傷是重要機制之一。本研究結果初步證實了口服NAC對PM2.5所致的肺損傷具有治療作用,作用機制可能在于減輕氧化應激、控制炎癥反應而實現,且治療劑量與效果存在一定的量效關系。相關的研究結果有待于更大樣本實驗加以驗證,其所涉及的信號通路值得進一步探討。

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