EZH2 shRNA對腎癌ACHN細胞增殖、凋亡及mTOR信號通路的影響

林建貴+莊志明+林天旗+楊明根+劉洪杰+鄭周達

[摘要] 目的 探討干擾沉默EZH2基因對腎癌ACHN細胞細胞株的增殖、凋亡及 mTOR信號通路的影響。 方法 設計針對EZH2基因干擾RNA（shRNA），經脂質體將轉染EZH2 shRNA入腎癌ACHN細胞，應用RQ-PCR 及 Western blot 鑒定其干擾效果，MTT法繪制細胞生長曲線，TUNEL檢測細胞凋亡的變化，Western blot 檢測組蛋白H3K27三甲基化水平（H3K27me3），凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Procaspase-3及mTOR信號通路蛋白mTOR、磷酸化mTOR蛋白（p-mTOR）、磷酸化P70核糖體蛋白S6激酶（phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase，p-P70S6K）的變化。結果 EZH2 shRNA轉染ACHN細胞48 h后，EZH2的 mRNA 和蛋白表達均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），EZH2 shRNA組細胞增殖率明顯低于 Neg shRNA 組和Control組（P<0.05），EZH2 shRNA組細胞的凋亡率為（45.57±5.26）%，而Neg shRNA 組和Control組分別為（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差異有統計學意義（F=48.62，P<0.05）。促進凋亡蛋白Bax表達增強，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達減弱，凋亡執行蛋白前體Procaspase3減少。H3K27me3水平較Control組明顯下降，而檢測mTOR通路蛋白發現mTOR總蛋白未見明顯下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表達下降。結論 干擾沉默EZH2基因可抑制腎癌ACHN細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能是調節組蛋白H3K27me3水平變化，特異性抑制mTOR信號通路的活性。

[關鍵詞] EZH2；H3K27me3；腎癌；RNA干擾mTOR信號通路

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）12（c）-0001-05

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the effect of silencing EZH2 geneon the proliferation， apoptosis andmTOR signalpathway in ACHN human renal cell carcinoma cells. Methods The interference of RNA （shRNA）aiming at EZH2 gene was designed， and EZH2 shRNA were transfected into ACHNhuman renal cell carcinoma cells through lipidosome. The interference effects were identified by RQ-PCR and Western blot， and cell growth curve was drawn by MTT method. Changes in apoptosiswere detected by TUNEL， and the histone H3K27 trimethylation level （H3K27me3）， changes in apoptosis related proteins Bcl-2， Bax and Procaspase-3， mTOR signalpathway proteins mTOR， phosphorylated mTOR protein （p-mTOR） and phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase （p-P70S6K） were detected by Western blot. Results The mRNA and protein of EZH2 were markedly decreased at 48 h after EZH2 shRNA being transfected into ACHN human renal cell carcinoma cells（P<0.05）. The cell proliferation rate in EZH2 shRNA group was significantly lower than that in Neg shRNA group and Control group （P<0.05）. The cell apoptosis rate inEZH2shRNA group was （45.57±5.26）%， while the rate in Neg shRNA group and Control group were （3.24±1.37）% and （1.65±0.94）%， respectively （F=48.62， P<0.05）. The expression of protein Baxpromoting apoptosiswas increased， the expression of Bcl-2 inhibiting apoptosis was weakened， and the apoptosis precursor protein Procaspase3 was decreased. The level of H3K27me3 was significantly lower than that in control group while the detection of mTOR pathway protein showed that the total protein of mTOR was not decrease significantly. Besides， the expression of phosphorylated p-mTOR and p-P70S6K in active forms was decreased. Conclusion Silencing EZH2 gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of ACHN human renal cell carcinoma cells， and the mechanism may be regulatingchanges in the level of histone H3K27me3 and specifically inhibiting the activity of mTOR signaling pathway.endprint

[Key words] EZH2； H3K27me3； Renal cell carcinoma； RNA interference mTOR singalpathway

腎癌是泌尿系統常見的腫瘤之一，我國泌尿生殖系惡性腫瘤中占第2位，發病率僅次于膀胱癌。但對于腎癌的發生、發展、侵襲轉移的確切的分子機制尚未完全清楚。目前多項研究證實，表觀遺傳學修飾異常是惡性腫瘤發生、發展、侵襲轉移的重要原因之一[1]。EZH2（Enhancer of Zeste Homolog 2）基因是果蠅 E（z）在人類的同源基因，EZH2基因是PcG（Polycomb group）基因家族的重要成員之一，特異性完成H3K27三甲基化修飾。EZH2在多種腫瘤組織中高表達，與腫瘤的進展及預后相關[2-3]。該次實驗通過shRNA干擾沉默人腎癌ACHN細胞EZH2基因，觀察其對ACHN細胞和mTOR信號通路的影響，以尋求EZH2基因在腎癌靶向治療中的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗細胞株來自科學院上海細胞庫，RPMI-1640培養基、胎牛血清來自美國Gibico公司，RNA提取試劑盒、RQ-PCR試劑盒、TUNNEL試劑盒、Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司，MTT（濃度為5 mg/mL）及二甲基亞砜均購自美國Sigma公司，EZH2、三甲基化H3K27（H3K27me3）一抗購自美國Upstate公司。Bcl-2、Bax、Procaspase-3、mTOR、磷酸化mTOR蛋白（p-mTOR）、磷酸化P70核糖體蛋白S6激酶（phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase，p-P70S6K）、β-actin、二抗及蛋白印跡法化學發光工作液都購自美國Santa Cruz 公司。

針對EZH2區域選擇相應的作用靶點，合成針對EZH2核心編碼區461-481bp結構為靶向的核苷酸片段（核苷酸序列為AAGACTCTGAATGCAGTTGCT）。委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成EZH2 shRNA，同時購買陰性shRNA（Neg shRNA）。PCR引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 試驗方法

細胞培養：在體積分數5%飽和濕度的CO2培養箱中使用含15%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養ACHN細胞株，培養箱溫度控制在37℃，每間隔1 d更換1次液體，傳代培養，選取對數生長期細胞進行實驗。

細胞轉染：將lipofectamineTM2000、Neg shRNA、EZH2 shRNA均使用Opti-MEM培養基稀釋，分別得到A液、B液、C液，將A液于室溫下放置5 min，再與C液混合并在室溫放置20 min使形成轉染復合物0.5 mL，將轉染復合物置于無抗培養基（含細胞）中，使終體積為2 mL，把細胞置于體積分數為5%的CO2培養箱中培養48 h，培養箱溫度控制在37℃，之后收集細胞，檢測EZH2 mRNA表達水平。

RT-PCR檢測EZH2 mRNA表達：按照Trizol說明書步驟提取總RNA，采用分光光度法檢測RNA濃度及純度，A260/A280比值介于1.8～2.0之間，逆轉錄為cDNA，PCR引物序列：EZH2上游引物5′-TTG TTG GCG GAA GCG TGT AAA ATC-3，下游引物5′-TCC CTA GTC CCG CGC AAT GAG C-3；β-actin上游引物5′-CTC GTC ATA CTC CTG CTT GCT-3′，下游引物5′-CGG GAC CTG ACT GAC TAC CTC-3′。2-ΔΔCt計算檢測基因mRNA相應表達量，每組各測3次，取平均值。

EZH2 shRNA對ACHN細胞增殖的影響：選擇對數生長期細胞，調整其濃度為1.0×105/mL，并接種于96孔細胞培養板（Costar）中，每孔100 μL，實驗分3組： Control組、 Neg shRNA 組、EZH2 shRNA 組，同時設立空白組（只加培養液），每組設8個平行孔，培養48 h后，每孔加20 μL MTT，再培養4 h，離心，分離上清液，向每孔加150 μL二甲基亞砜并震蕩，充分溶解結晶物，在酶標儀上用雙波長492 nm和630 nm測吸光度（OD值）。細胞增殖率（%）=（OD實驗-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。上述步驟重復 3 次，細胞增殖率取平均值。EZH2 shRNA對ACHN細胞凋亡的影響實驗分3組：Control組、Neg shRNA 組、EZH2 shRNA 組，培養48 h后收集細胞。按TUNEL試劑盒說明書操作方法，計數5個視野，每個視野計數200個細胞，計算細胞的凋亡率。

EZH2 shRNA對ACHN細胞凋亡相關蛋白及對mTOR信號通路相關蛋白的影響：將作用24 h后的細胞預冷PBS離心洗滌兩次，吸干。根據 1×106 細胞加入 100 μL 裂解液+1 μL酶抑制劑的比例冰上裂解細胞30 min，置于4℃條件下離心10 min， 10 000×g，去掉上層清液，取中間清亮層進行蛋白定量（BCA法）后用12%的SDS-PAGE進行電泳分離再轉膜，于室溫下搖床封閉1 h，加入用TBS（濃度根據一抗稀釋）并置于4℃環境下過夜，使用TBS洗滌液洗膜，并將其分別置于TBS稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶5 000），進行1 h搖床作用，洗膜（TBS）后使用化學發光法顯色，X射線底片曝光，將β-actin作為內參照，掃描結束后使用AlphaDigiDoc 圖像分析軟件進行分析。

1.3 統計方法

數據分析用SPSS 20.0統計學軟件處理，檢驗方差齊性，計量資料以（x±s）表示，以單因素方差分析進行組間比較，P﹤0.05為差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 EZH2 shRNA下調ACHN細胞EZH2 mRNA、EZH2蛋白表達

EZH2 shRNA處理ACHN細胞48 h后，使用RQ-PCR檢測EZH2 mRNA的變化，EZH2 shRNA組：（0.137±0.042），Neg shRNA組：（0.988±0.124），Control組：（1.108±0.095），EZH2 shRNA組與Control組差異有統計學意義（n=3，P<0.05），Neg-shRNA組與Control組差異無統計學意義（n=3，P>0.05）（圖1）；Western blot檢測EZH2蛋白的變化，EZH2 shRNA組：（0.102±0.015），Neg shRNA組：（1.108±0.074），Control組：（1.139±0.058），EZH2 shRNA組與Control組差異有統計學意義（n=3，P<0.05），Neg-shRNA組與Control組差異無統計學意義（n=3，P>0.05） （圖5）。

2.2 EZH2 shRNA抑制ACHN細胞增殖

Control組為在48 h細胞的增殖率為（97.24±1.37）% ，Neg shRNA 組在48 h細胞的增殖率為（95.65±1.29）%，兩組間比較差異無統計學意義（P>0.05），EZH2 shRNA組細胞增殖（43.83±2.42）%較Control組和Neg shRNA 組明顯較低，差異有統計學意義（P<0.05），表明EZH2 shRNA有效抑制ACHN細胞增殖的能力（圖2）。

2.3 EZH2 shRNA誘導ACHN細胞凋亡

EZH2 shRNA處理ACHN細細胞48 h后，EZH2 shRNA組細胞的凋亡率為（45.57±5.26）%，而Neg shRNA 組和Control組分別為（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差異有統計學意義（F=48.62，P<0.05）（圖3） 。

2.4 EZH2 shRNA上調ACHN細胞的Bax蛋白，下調Bcl-2、Procaspase3 的表達

48 h后Bax表達相較之前明顯增加，Bcl-2表達明顯減弱，Procaspase3明顯減少，細胞凋亡發生（圖4）。

2.5 EZH2 shRNA下調ACHN細胞H3K27me3及mTOR通路的磷酸化水平

EZH2 shRNA干擾沉默EZH2基因表達48 h后，Western blot檢測發現ACHN細胞組蛋白H3K27me3水平較Control組明顯下降，而檢測mTOR通路蛋白發現mTOR總蛋白未見明顯下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表達下降，提示EZH2 shRNA可以以去磷酸化形式抑制mTOR通路（圖5）。

3 討論

EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蠅 E（z）基因、小鼠Ezh1和Ezh2基因在人類的同源物，是PcG家族中 PRC2 蛋白復合物的催化活性部位。本基因在進化上保守程度高，N端含3個與果蠅 E（z）基因高度同源的序列，C端包含一高度進化保守的SET結構域，該結構域與染色體相關的基因表達相關緊密，是EZH2基因介導轉錄抑制不可或缺的部分，如果本結構域丟失的話就不會產生抑制表現，甚至在某些情況下可能使基因去抑制化[4]。EZH2的SET結構域具有組蛋白甲基轉移酶的活性，可以對核小體組蛋白H3的27位賴氨酸進行三甲基化修飾，三甲基化后的H3K27（H3K27me3）可以將PRC2復合物招募到特定的基因位點，抑制靶基因的轉錄[5]，這些靶基因中包含一些腫瘤抑制基因，它們在細胞周期調節、細胞分化、衰老、腫瘤發生等方面發揮重要作用[6]。

近年來研究顯示，多種惡性腫瘤均發現EZH2過量表達，但在良性腫瘤中并未發現這種情況，表示EZH2的異常表達可以作為區分良性腫瘤和惡性腫瘤的標記之一[7]。Kleer 等[8]發現乳腺癌的EZH2蛋白水平與乳腺癌侵襲性高度相關，并且對患者的預后與 EZH2 的表達關系進行分析，EZH2 與腫瘤大小、分期、淋巴結轉移呈正相關，是乳腺癌的獨立預后因素。 EZH2 異常高表達，可以促進乳腺癌細胞增殖和侵襲轉移，患者預后差且復發率高[8]。EZH2與泌尿系腫瘤的發生、發展也密切相關。在膀胱癌組織EZH2 表達水平隨著腫瘤分級分期的提高而增加，且高表達者復發時間縮短，為預后不良指標。EZH2在轉移性前列腺癌的組織表達水平較良性或臨床局限性病變顯著升高，且與前列腺癌患者的不良預后密切相關。下調 EZH2 蛋白可抑制前列腺癌細胞生長，阻滯細胞周期在 G2/M 期[10]。腎癌組織中，EZH2表達明顯較高，且EZH2表達水平與腫瘤分期、病理分級等均呈正相關，EZH2表達陽性的患者術后5年生存率較差[11]。使用 siRNA技術干擾沉默腎癌769-P細胞中EZH2基因的表達，發現可以抑制腫瘤細胞的增殖能力，使細胞周期阻滯在G0/G1期[12]。

該次研究也發現EZH2 shRNA能明顯下調ACHN細胞EZH2 mRNA、EZH2蛋白表達，EZH2 shRNA轉染細胞48 h后細胞增殖率為（43.83±2.42）%，顯著低于Control組的（97.24±1.37）% 和Neg shRNA 組的（95.65±1.29）%，EZH2 shRNA可有效抑制Jeko-1細胞增殖能力。進一步使用Western blot檢測發現Bax表達增加，Bcl-2表達減弱，Procaspase3減少，EZH2 shRNA組的細胞凋亡率為（45.57±5.26）%，顯著高于Neg shRNA 組和Control組的（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差異有統計學意義（F=48.62，P<0.01），證實EZH2 shRNA可以誘導細胞的凋亡。endprint

mTOR信號通路作為細胞內重要的信號轉導途徑之一，在腫瘤細胞的發生發展過程中起到重要作用。本項研究表明，mTOR信號途徑異常激活可以導致腎癌細胞抗凋亡能力、細胞增殖、腫瘤的侵襲和轉移能力增強。通過信號抑制劑阻斷mTOR效應分子活化、促進細胞凋亡已經成為治療腎癌的新思路[13-14]。mTOR信號通路活性受到組蛋白甲基化水平的調節，在體外沉默前列腺癌的組蛋白甲基化酶SMYD基因后，發現mTOR信號通路出現抑制，細胞增殖受限細胞，凋亡增加[15]。該次研究也發現EZH2基因表達下降后，H3K27me3水平明顯下降， mTOR總蛋白未見明顯下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表達下降，表明EZH2 shRNA可以以去磷酸化形式抑制mTOR通路。

綜上所述，干擾沉默EZH2基因后，調節組蛋白H3K27me3的水平，抑制mTOR信號通路活性，腎癌ACHN細胞增殖能力下降，細胞凋亡增加，提示以EZH2作為抗腫瘤靶點的研究具有良好的應用前景

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（收稿日期：2017-09-21）endprint