EZH2 shRNA對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞增殖、凋亡及mTOR信號(hào)通路的影響

林建貴+莊志明+林天旗+楊明根+劉洪杰+鄭周達(dá)

[摘要] 目的 探討干擾沉默EZH2基因?qū)δI癌ACHN細(xì)胞細(xì)胞株的增殖、凋亡及 mTOR信號(hào)通路的影響。 方法 設(shè)計(jì)針對(duì)EZH2基因干擾RNA（shRNA），經(jīng)脂質(zhì)體將轉(zhuǎn)染EZH2 shRNA入腎癌ACHN細(xì)胞，應(yīng)用RQ-PCR 及 Western blot 鑒定其干擾效果，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，Western blot 檢測(cè)組蛋白H3K27三甲基化水平（H3K27me3），凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Procaspase-3及mTOR信號(hào)通路蛋白mTOR、磷酸化mTOR蛋白（p-mTOR）、磷酸化P70核糖體蛋白S6激酶（phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase，p-P70S6K）的變化。結(jié)果 EZH2 shRNA轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞48 h后，EZH2的 mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EZH2 shRNA組細(xì)胞增殖率明顯低于 Neg shRNA 組和Control組（P<0.05），EZH2 shRNA組細(xì)胞的凋亡率為（45.57±5.26）%，而Neg shRNA 組和Control組分別為（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.62，P<0.05）。促進(jìn)凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)減弱，凋亡執(zhí)行蛋白前體Procaspase3減少。H3K27me3水平較Control組明顯下降，而檢測(cè)mTOR通路蛋白發(fā)現(xiàn)mTOR總蛋白未見(jiàn)明顯下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表達(dá)下降。結(jié)論 干擾沉默EZH2基因可抑制腎癌ACHN細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是調(diào)節(jié)組蛋白H3K27me3水平變化，特異性抑制mTOR信號(hào)通路的活性。

[關(guān)鍵詞] EZH2；H3K27me3；腎癌；RNA干擾mTOR信號(hào)通路

[中圖分類(lèi)號(hào)] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）12（c）-0001-05

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the effect of silencing EZH2 geneon the proliferation， apoptosis andmTOR signalpathway in ACHN human renal cell carcinoma cells. Methods The interference of RNA （shRNA）aiming at EZH2 gene was designed， and EZH2 shRNA were transfected into ACHNhuman renal cell carcinoma cells through lipidosome. The interference effects were identified by RQ-PCR and Western blot， and cell growth curve was drawn by MTT method. Changes in apoptosiswere detected by TUNEL， and the histone H3K27 trimethylation level （H3K27me3）， changes in apoptosis related proteins Bcl-2， Bax and Procaspase-3， mTOR signalpathway proteins mTOR， phosphorylated mTOR protein （p-mTOR） and phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase （p-P70S6K） were detected by Western blot. Results The mRNA and protein of EZH2 were markedly decreased at 48 h after EZH2 shRNA being transfected into ACHN human renal cell carcinoma cells（P<0.05）. The cell proliferation rate in EZH2 shRNA group was significantly lower than that in Neg shRNA group and Control group （P<0.05）. The cell apoptosis rate inEZH2shRNA group was （45.57±5.26）%， while the rate in Neg shRNA group and Control group were （3.24±1.37）% and （1.65±0.94）%， respectively （F=48.62， P<0.05）. The expression of protein Baxpromoting apoptosiswas increased， the expression of Bcl-2 inhibiting apoptosis was weakened， and the apoptosis precursor protein Procaspase3 was decreased. The level of H3K27me3 was significantly lower than that in control group while the detection of mTOR pathway protein showed that the total protein of mTOR was not decrease significantly. Besides， the expression of phosphorylated p-mTOR and p-P70S6K in active forms was decreased. Conclusion Silencing EZH2 gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of ACHN human renal cell carcinoma cells， and the mechanism may be regulatingchanges in the level of histone H3K27me3 and specifically inhibiting the activity of mTOR signaling pathway.endprint

[Key words] EZH2； H3K27me3； Renal cell carcinoma； RNA interference mTOR singalpathway

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤之一，我國(guó)泌尿生殖系惡性腫瘤中占第2位，發(fā)病率僅次于膀胱癌。但對(duì)于腎癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的確切的分子機(jī)制尚未完全清楚。目前多項(xiàng)研究證實(shí)，表觀(guān)遺傳學(xué)修飾異常是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因之一[1]。EZH2（Enhancer of Zeste Homolog 2）基因是果蠅 E（z）在人類(lèi)的同源基因，EZH2基因是PcG（Polycomb group）基因家族的重要成員之一，特異性完成H3K27三甲基化修飾。EZH2在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)[2-3]。該次實(shí)驗(yàn)通過(guò)shRNA干擾沉默人腎癌ACHN細(xì)胞EZH2基因，觀(guān)察其對(duì)ACHN細(xì)胞和mTOR信號(hào)通路的影響，以尋求EZH2基因在腎癌靶向治療中的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株來(lái)自科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清來(lái)自美國(guó)Gibico公司，RNA提取試劑盒、RQ-PCR試劑盒、TUNNEL試劑盒、Lipofectamine 2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，MTT（濃度為5 mg/mL）及二甲基亞砜均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，EZH2、三甲基化H3K27（H3K27me3）一抗購(gòu)自美國(guó)Upstate公司。Bcl-2、Bax、Procaspase-3、mTOR、磷酸化mTOR蛋白（p-mTOR）、磷酸化P70核糖體蛋白S6激酶（phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase，p-P70S6K）、β-actin、二抗及蛋白印跡法化學(xué)發(fā)光工作液都購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

針對(duì)EZH2區(qū)域選擇相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，合成針對(duì)EZH2核心編碼區(qū)461-481bp結(jié)構(gòu)為靶向的核苷酸片段（核苷酸序列為AAGACTCTGAATGCAGTTGCT）。委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成EZH2 shRNA，同時(shí)購(gòu)買(mǎi)陰性shRNA（Neg shRNA）。PCR引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)：在體積分?jǐn)?shù)5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中使用含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)ACHN細(xì)胞株，培養(yǎng)箱溫度控制在37℃，每間隔1 d更換1次液體，傳代培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將lipofectamineTM2000、Neg shRNA、EZH2 shRNA均使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān)謩e得到A液、B液、C液，將A液于室溫下放置5 min，再與C液混合并在室溫放置20 min使形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物0.5 mL，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物置于無(wú)抗培養(yǎng)基（含細(xì)胞）中，使終體積為2 mL，把細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)箱溫度控制在37℃，之后收集細(xì)胞，檢測(cè)EZH2 mRNA表達(dá)水平。

RT-PCR檢測(cè)EZH2 mRNA表達(dá)：按照Trizol說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA，采用分光光度法檢測(cè)RNA濃度及純度，A260/A280比值介于1.8～2.0之間，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR引物序列：EZH2上游引物5′-TTG TTG GCG GAA GCG TGT AAA ATC-3，下游引物5′-TCC CTA GTC CCG CGC AAT GAG C-3；β-actin上游引物5′-CTC GTC ATA CTC CTG CTT GCT-3′，下游引物5′-CGG GAC CTG ACT GAC TAC CTC-3′。2-ΔΔCt計(jì)算檢測(cè)基因mRNA相應(yīng)表達(dá)量，每組各測(cè)3次，取平均值。

EZH2 shRNA對(duì)ACHN細(xì)胞增殖的影響：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1.0×105/mL，并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar）中，每孔100 μL，實(shí)驗(yàn)分3組： Control組、 Neg shRNA 組、EZH2 shRNA 組，同時(shí)設(shè)立空白組（只加培養(yǎng)液），每組設(shè)8個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL MTT，再培養(yǎng)4 h，離心，分離上清液，向每孔加150 μL二甲基亞砜并震蕩，充分溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上用雙波長(zhǎng)492 nm和630 nm測(cè)吸光度（OD值）。細(xì)胞增殖率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）×100%。上述步驟重復(fù) 3 次，細(xì)胞增殖率取平均值。EZH2 shRNA對(duì)ACHN細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)分3組：Control組、Neg shRNA 組、EZH2 shRNA 組，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法，計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

EZH2 shRNA對(duì)ACHN細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響：將作用24 h后的細(xì)胞預(yù)冷PBS離心洗滌兩次，吸干。根據(jù) 1×106 細(xì)胞加入 100 μL 裂解液+1 μL酶抑制劑的比例冰上裂解細(xì)胞30 min，置于4℃條件下離心10 min， 10 000×g，去掉上層清液，取中間清亮層進(jìn)行蛋白定量（BCA法）后用12%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離再轉(zhuǎn)膜，于室溫下?lián)u床封閉1 h，加入用TBS（濃度根據(jù)一抗稀釋?zhuān)┎⒅糜?℃環(huán)境下過(guò)夜，使用TBS洗滌液洗膜，并將其分別置于TBS稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶5 000），進(jìn)行1 h搖床作用，洗膜（TBS）后使用化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線(xiàn)底片曝光，將β-actin作為內(nèi)參照，掃描結(jié)束后使用AlphaDigiDoc 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，檢驗(yàn)方差齊性，計(jì)量資料以（x±s）表示，以單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 EZH2 shRNA下調(diào)ACHN細(xì)胞EZH2 mRNA、EZH2蛋白表達(dá)

EZH2 shRNA處理ACHN細(xì)胞48 h后，使用RQ-PCR檢測(cè)EZH2 mRNA的變化，EZH2 shRNA組：（0.137±0.042），Neg shRNA組：（0.988±0.124），Control組：（1.108±0.095），EZH2 shRNA組與Control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P<0.05），Neg-shRNA組與Control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P>0.05）（圖1）；Western blot檢測(cè)EZH2蛋白的變化，EZH2 shRNA組：（0.102±0.015），Neg shRNA組：（1.108±0.074），Control組：（1.139±0.058），EZH2 shRNA組與Control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P<0.05），Neg-shRNA組與Control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P>0.05） （圖5）。

2.2 EZH2 shRNA抑制ACHN細(xì)胞增殖

Control組為在48 h細(xì)胞的增殖率為（97.24±1.37）% ，Neg shRNA 組在48 h細(xì)胞的增殖率為（95.65±1.29）%，兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），EZH2 shRNA組細(xì)胞增殖（43.83±2.42）%較Control組和Neg shRNA 組明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明EZH2 shRNA有效抑制ACHN細(xì)胞增殖的能力（圖2）。

2.3 EZH2 shRNA誘導(dǎo)ACHN細(xì)胞凋亡

EZH2 shRNA處理ACHN細(xì)細(xì)胞48 h后，EZH2 shRNA組細(xì)胞的凋亡率為（45.57±5.26）%，而Neg shRNA 組和Control組分別為（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.62，P<0.05）（圖3） 。

2.4 EZH2 shRNA上調(diào)ACHN細(xì)胞的Bax蛋白，下調(diào)Bcl-2、Procaspase3 的表達(dá)

48 h后Bax表達(dá)相較之前明顯增加，Bcl-2表達(dá)明顯減弱，Procaspase3明顯減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生（圖4）。

2.5 EZH2 shRNA下調(diào)ACHN細(xì)胞H3K27me3及mTOR通路的磷酸化水平

EZH2 shRNA干擾沉默EZH2基因表達(dá)48 h后，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ACHN細(xì)胞組蛋白H3K27me3水平較Control組明顯下降，而檢測(cè)mTOR通路蛋白發(fā)現(xiàn)mTOR總蛋白未見(jiàn)明顯下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表達(dá)下降，提示EZH2 shRNA可以以去磷酸化形式抑制mTOR通路（圖5）。

3 討論

EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蠅 E（z）基因、小鼠Ezh1和Ezh2基因在人類(lèi)的同源物，是PcG家族中 PRC2 蛋白復(fù)合物的催化活性部位。本基因在進(jìn)化上保守程度高，N端含3個(gè)與果蠅 E（z）基因高度同源的序列，C端包含一高度進(jìn)化保守的SET結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與染色體相關(guān)的基因表達(dá)相關(guān)緊密，是EZH2基因介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制不可或缺的部分，如果本結(jié)構(gòu)域丟失的話(huà)就不會(huì)產(chǎn)生抑制表現(xiàn)，甚至在某些情況下可能使基因去抑制化[4]。EZH2的SET結(jié)構(gòu)域具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，可以對(duì)核小體組蛋白H3的27位賴(lài)氨酸進(jìn)行三甲基化修飾，三甲基化后的H3K27（H3K27me3）可以將PRC2復(fù)合物招募到特定的基因位點(diǎn)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[5]，這些靶基因中包含一些腫瘤抑制基因，它們?cè)诩?xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、衰老、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用[6]。

近年來(lái)研究顯示，多種惡性腫瘤均發(fā)現(xiàn)EZH2過(guò)量表達(dá)，但在良性腫瘤中并未發(fā)現(xiàn)這種情況，表示EZH2的異常表達(dá)可以作為區(qū)分良性腫瘤和惡性腫瘤的標(biāo)記之一[7]。Kleer 等[8]發(fā)現(xiàn)乳腺癌的EZH2蛋白水平與乳腺癌侵襲性高度相關(guān)，并且對(duì)患者的預(yù)后與 EZH2 的表達(dá)關(guān)系進(jìn)行分析，EZH2 與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。 EZH2 異常高表達(dá)，可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差且復(fù)發(fā)率高[8]。EZH2與泌尿系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。在膀胱癌組織EZH2 表達(dá)水平隨著腫瘤分級(jí)分期的提高而增加，且高表達(dá)者復(fù)發(fā)時(shí)間縮短，為預(yù)后不良指標(biāo)。EZH2在轉(zhuǎn)移性前列腺癌的組織表達(dá)水平較良性或臨床局限性病變顯著升高，且與前列腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。下調(diào) EZH2 蛋白可抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期在 G2/M 期[10]。腎癌組織中，EZH2表達(dá)明顯較高，且EZH2表達(dá)水平與腫瘤分期、病理分級(jí)等均呈正相關(guān)，EZH2表達(dá)陽(yáng)性的患者術(shù)后5年生存率較差[11]。使用 siRNA技術(shù)干擾沉默腎癌769-P細(xì)胞中EZH2基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[12]。

該次研究也發(fā)現(xiàn)EZH2 shRNA能明顯下調(diào)ACHN細(xì)胞EZH2 mRNA、EZH2蛋白表達(dá)，EZH2 shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖率為（43.83±2.42）%，顯著低于Control組的（97.24±1.37）% 和Neg shRNA 組的（95.65±1.29）%，EZH2 shRNA可有效抑制Jeko-1細(xì)胞增殖能力。進(jìn)一步使用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減弱，Procaspase3減少，EZH2 shRNA組的細(xì)胞凋亡率為（45.57±5.26）%，顯著高于Neg shRNA 組和Control組的（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.62，P<0.01），證實(shí)EZH2 shRNA可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。endprint

mTOR信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。本項(xiàng)研究表明，mTOR信號(hào)途徑異常激活可以導(dǎo)致腎癌細(xì)胞抗凋亡能力、細(xì)胞增殖、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。通過(guò)信號(hào)抑制劑阻斷mTOR效應(yīng)分子活化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療腎癌的新思路[13-14]。mTOR信號(hào)通路活性受到組蛋白甲基化水平的調(diào)節(jié)，在體外沉默前列腺癌的組蛋白甲基化酶SMYD基因后，發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路出現(xiàn)抑制，細(xì)胞增殖受限細(xì)胞，凋亡增加[15]。該次研究也發(fā)現(xiàn)EZH2基因表達(dá)下降后，H3K27me3水平明顯下降， mTOR總蛋白未見(jiàn)明顯下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表達(dá)下降，表明EZH2 shRNA可以以去磷酸化形式抑制mTOR通路。

綜上所述，干擾沉默EZH2基因后，調(diào)節(jié)組蛋白H3K27me3的水平，抑制mTOR信號(hào)通路活性，腎癌ACHN細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞凋亡增加，提示以EZH2作為抗腫瘤靶點(diǎn)的研究具有良好的應(yīng)用前景

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（收稿日期：2017-09-21）endprint