神經細胞分化中microRNA-134靶基因網絡功能分析*

蘇立寧，尹海峰，宋小青，魏會平

（河北北方學院基礎醫學院，河北 張家口 075000）

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種重要的多功能干細胞，具有取材方便，分化易控制等特點。研究表明，在合適的誘導條件下BMSCs可向成骨細胞、肌細胞、軟骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞和內皮細胞等多方向分化[1-7]。研究[8-9]發現在特殊的培養條件下，BMSCs可分化為神經細胞，但有關其分子機制還有待進一步研究。

MicroRNAs，是一種短的非編碼單鏈RNA，長約20～24個核苷酸，通過堿基互補配對原則，與mRNA結合，直接靶向切割mRNA或抑制靶基因的翻譯對轉錄后基因表達進行調控。MicroRNAs通過與mRNA結合可調控神經系統發育和功能[10]，腦特異性microRNA-134在神經突生成及突觸成熟等發育階段發揮調控作用[10-11]。研究[12]表明microRNA-134通過抑制單絲氨酸蛋白激酶1（LIM-kinase 1，LIMK1）控制神經突的生成或脊柱的生長，通過降低胚胎干細胞關鍵蛋白NANOG和肝受體類似物LRH1的轉錄后表達調節小鼠BMSCs的分化[13]。本實驗推測microRNA-134在神經分化過程中發揮重要作用。

為了進一步驗證microRNA-134在BMSCs向神經分化過程中的功能，本實驗檢測了神經分化過程中microRNA-134表達量的變化，利用生物信息學軟件對其靶基因進行預測，結合所研究的目標，分析與神經分化相關的基因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～6周齡大鼠3只，購自河北北方學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑

DMEM購自美國Gibco公司，堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自上海PrimeGene Bio-Tech公司，RNA提取試劑盒和兔抗神經元特異性烯醇化酶（NSE）引物購自日本TaKaRa公司，兔抗巢蛋白（nestin）和NSE購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 BMSCs的分離與培養

頸椎脫臼法處死大鼠，75%的酒精浸泡10 min消毒，無菌條件下取出股骨，置無菌PBS液中清洗2次，露出骨髓腔，用5 ml的無菌注射器吸取含有10%胎牛血清的DMEM培養液沖洗骨髓腔，收集洗液，置無菌培養瓶中培養，72 h后換液去除未貼壁的細胞，每隔3 d換液1次，待細胞密度達80%左右時按1∶2進行傳代，直至第4代。流式細胞儀檢測BMSCs的表面標志物。

1.4 BMSCs誘導分化為神經細胞

取第4代的細胞分為兩組，對照組不加任何因子，誘導組加入含20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的誘導液。對照組每隔3 d換液1次，誘導組每隔2 d半量換液。

1.5 MicroRNA-134表達量分析

收集對照組細胞和誘導組細胞（誘導1、2、3、4 d）。利用RNA提取試劑盒分別提取兩組總RNA。采用microRNA-134逆轉錄引物，逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測microRNA-134在兩組不同時間點的表達量變化，反應體系為95℃ 5 min，94℃ 30 s 40個循環，60℃30 s，72℃ 30 s。成熟 microRNA-134的正向擴增引物為5'-CGTGTGACTGGTTGACC-3'，反向引物5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'。內參β-actin 的正向引物為5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，反向引物為5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。采用Ct值比較法[14]，比較兩組的表達差異。

1.6 MicroRNA-134靶基因預測及GO功能富集

利用數據庫miRWalk[15]對microRNA-134靶基因進行預測。預測得到的靶基因上傳至DAVID數據庫進行Gene Ontology（GO）功能富集分析，篩選與神經分化相關的基因，應用Fisher’s exact test方法選取P＜0.05注釋基因條目。

1.7 神經分化相關基因蛋白互作網絡構建及分析

將選取的神經分化相關基因輸入到STRING 10[16]數據庫中，選取交互作用評分＜0.7（高等可信度）的互作關系構建神經分化相關基因的蛋白互作網 絡（protein- protein interaction network，PPI）。 網絡分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape3.2.1軟件[17]進行，且利用“Network Analyzer”工具對各節點的“度”進行計算。“度”代表了與目標蛋白相互作用的蛋白的數量。網絡中，節點越大，“度”越大。利用 Cytoscape3.2.1軟件中的“ClusterONE”工具對蛋白質相互作用網絡進行功能模塊分析，篩選標準為minimum size=6，minimum density=0.05，P＜0.05。

1.8 統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各指標間比較采用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的鑒定結果

大鼠骨髓中獲取的間充質干細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養48 h后半量換液，待細胞密度達80%～90%傳代，3代細胞生長較穩定，密度較均勻，形態以長梭形為主，符合BMSCs的細胞形態特征。待細胞傳至4代，流式細胞儀檢測細胞的表面標志物，檢測結果顯示，標志物CD29和CD90表達陽性，CD34和CD45表達弱陽性，符合骨髓間充質干細胞的特點（見圖1）。

圖1 BMSLs的鑒定結果

2.2 BMSCs向神經細胞的誘導分化結果

向傳至第4代的BMSCs中加入含20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的誘導液，誘導2～3 d后，出現少量的神經樣細胞；繼續誘導4 d，大部分已分化為神經樣細胞（見圖2A）。免疫組織化學法檢測分化后神經細胞標志物nestin和NSE的表達量，結果為陽性（見圖2B）。收集對照組誘導1～4 d的細胞，利用qRTPCR進行NSE基因表達量的檢測，結果顯示誘導4 d后，NSE基因的表達量達到高峰。與對照組相比，誘導組1～4 d后表達量分別升高1.08、1.25、2.01和2.94倍（見圖2C），其中，誘導組第3和4天表達量與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 BMSCs誘導分化后microRNA-134表達量的變化

誘導組與對照組細胞培養1、2、3及4 d的microRNA-134表達量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的microRNA-134表達量有差別（F=69.711，P=0.003），②誘導組與對照組細胞的microRNA-134表達量有差別（F=18.096，P=0.021），誘導組與對照組相比microRNA-134表達量較高，可誘導BMSCs細胞向神經細胞分化，③不同誘導時間和誘導方法間存在交互作用，誘導組與對照組的不同誘導時間有差別（F=5.390，P=0.014）。見表1。

2.4 MicroRNA-134靶基因網絡相互作用分析

為了進一步研究microRNA-134在神經分化中的作用，利用在線數據庫miRWalk預測microRNA-134靶基因，得到1 220個靶基因。將靶基因輸入到DAVID軟件6.7中進行GO（P＜0.05）功能富集分析，選取與神經分化相關的GO功能組：GO 0030182和GO 0048667（見表2）。

2.5 GO 0030182和GO 0048667 PPI網絡分析

圖2 BMSCs分化為神經細胞的鑒定結果

表1 microRNA-134表達量的變化 （±s）

表1 microRNA-134表達量的變化 （±s）

組別 第1天 第2天 第3天 第4天對照組 0.018±0.002 0.019±0.002 0.021±0.002 0.021±0.001誘導組 0.037±0.003 0.041±0.003 0.045±0.003 0.050±0.002

表2 與神經分化相關的microRNA-134靶基因

為了預測與神經元分化相關的靶基因（GO 0030182和GO 0048667）及與其他基因之間的蛋白質相互作用，利用STRING10數據庫構建PPI網絡，然后利用生物圖表可視化工具Cytoscape3.2.1軟件進行網絡分析，且利用“Network Analyzer”工具對各節點的“度”進行計算（見圖3）。構建結果顯示，21個靶基因蛋白均與STRING數據庫中蛋白質匹配，這21個基因為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、靶向整合素β1（Integrinβ1，ITGB1）、血小板激活因子乙酰水解酶bata1（plateletactivating factor acetylhydrolase，PAFAH1B1）、蛋白激酶C（Protein kinase C alpha，PRKCA）、酪氨酸蛋白激酶A4（tyrosine protein kinase A4，EPHA4）、肝配蛋白A2（Ephrin-A2，EFNA2）、NK6 同源框蛋白 1（NKX6-1）、神經細胞黏著分子（neural cell adhesion molecule，NRCAM）、突觸融合蛋白結合蛋白1基因（synaptic fusion protein binding protein 1 gene，STXBP1）、鉀離子通道相關作用蛋白2（Kv channel-interacting protein 2，KCNIP2）、蛋白磷酸酶ABI2、腺嘌呤核苷A2a受體（adenine nucleoside both A2a receptors，ADORA2A）、接觸蛋白2（contactin-2，CNTN2）、鋅指轉錄因子DST、叉頭狀轉錄因子 FOXA1（forkhead box A1）、SEPT2（septin-2）、微管相關蛋白 Doublecortin（DCX）、ETS變異基因1（ETS gene variant 1，ETV1）、腱蛋白樣蛋白1（cordin-like 1，CHRDL1）、生長休止蛋白7（growth arrest-specific，GAS7）和蛋白酪氨酸磷酸酶受體M（protein tyrosine phosphatase receptor type M，PTPRM）。利用Cytoscape3.2.1軟件中的“ClusterONE”工具進行了模塊分析，結果12個基因被聚集在模塊中（見圖4）。

圖3 MicroRNA-134靶基因PPI網絡分析

圖4 MicroRNA-134靶基因相互作用網絡的11個模塊 黃色節點代表靶基因，紅色節點代表與靶基因蛋白相互作用的蛋白。節點越大，“度”越大

3 討論

MicroRNAs通過作用于靶基因調控細胞分化等各種生物學過程。

MicroRNA-134具有腦特異性，在神經中樞中高表達。而microRNA-134在BMSCs誘導分化為神經細胞過程中的作用機制還有待研究。

許多研究已證明EGF和bFGF聯合作用可以誘導BMSCs向神經細胞分化[18]，因此本實驗選擇的誘導劑為EGF和bFGF。利用qRT-PCR檢測microRNA-134在各實驗組的表達量變化，誘導組隨誘導時間的遞增表達量升高。因此初步假設microRNA-134在促進BMSCs分化為神經細胞過程中發揮作用。以往的研究證明[19]，microRNA-134通過降低轉錄因子蛋白FOXM1的表達量調控人類多能干細胞分化發揮作用。神經系統中，LIMK1通過抑制microRNA-134的表達量調節神經突的生成、脊柱的生長及樹突棘的大小[12，20]。另外還有研究發現沉默信息調節因子2相關酶1通過轉錄抑制因子復合體作用于microRNA-134調控神經突觸的可塑性[21]。本實驗初步驗證了在神經分化過程中microRNA-134表達量升高，與前人的結論一致。MicroRNA-134以哪些基因為靶基因調控神經分化，在本文中進行了理論的預測。

本文以miRWalk和DAVID數據庫為依據，以GO功能為基礎篩選了與神經分化相關的microRNA-134靶基因（GO 0030182和GO 0048667），并構建了PPI網絡圖，通過ClusterONE功能模塊分析發現CASP3，ITGB1，PAFAH1B1，PRKCA，EFNA2，NKX6-1，NRCAM，STXBP1，KCNIP2，ABI2，CNTN2，FOXA1等12個基因聚集在11個模塊中發揮作用，說明這12個基因作用在神經分化中比較重要。NKX6-1，是一種同源框轉錄因子，通過調控3個神經元軸突導向分子的表達量控制神經元軸突的生長[22]，且通過與PR結構域蛋白12的交叉抑制作用促進中間神經元的生長[23]。FOXA1，作為一種轉錄因子，可調控中腦多巴胺能神經元的分化[24]，CNTN2在早期腦神經節和脊髓運動神經元中不表達，而在成熟神經元中表達[25]。

綜上所述，本文初步驗證了microRNA-134在促進BMSCs向神經細胞分化的過程中發揮重要作用，應用生物信息學的方法分析了在神經分化中發揮作用的microRNA-134的靶基因，并篩選了與神經分化相關的12個關鍵蛋白，但這些蛋白的作用還需實驗的進一步驗證。

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