α7nAChR激動劑對大鼠移植肺缺血再灌注損傷的保護作用*

趙正維，王海強，尹遜亮，張志培，李小飛，周勇安

（第四軍醫大學唐都醫院 胸外科，陜西 西安 710038）

隨著器官移植領域的研究進展和技術進步，肺移植術后患者存活率及生活質量得到巨大的改善，肺移植被認為是治療終末期肺疾病的重要手段[1]。但是目前，肺移植術后仍會有諸多并發癥，其早期最為嚴重的并發癥便是移植肺的缺血再灌注損傷（ischemia and reperfusion，I/R），它是引起移植肺功能喪失和患者死亡的首要原因[2-3]。怎樣預防和減輕移植肺的I/R一直以來都是肺移植領域的研究熱點。已有文獻報道，I/R過程中的炎癥反應可以有效地被α7nAChR激動劑（PNU 282987）抑制[4]。本實驗通過復制同種異體大鼠左肺移植動物模型，探討α7nAChR激動劑對大鼠肺移植中I/R的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性近交系成年SD大鼠40只，體重200～250 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。其中32只作為供受體，供、受體之間體重差不超過20 g。PNU 282987購自（美國）Tocris公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將雄性SD大鼠隨機分為3組，所有大鼠術前禁食12 h，不禁水。A組為假手術組（8只）：該組大鼠僅行機械通氣和開胸手術，不行缺血和再灌注處理；B組為生理鹽水處理的I/R組（16只）：該組行左肺原位移植，移植成功后受體腹腔注射等量生理鹽水替代 PNU 282987。C組為PNU 282987處理組（16只）：該組大鼠同樣行左肺原位移植，移植成功后受體腹腔注射PNU 282987 2.4 mg/kg[5]。

1.2.2 移植模型 復制同種異體大鼠左肺原位移植模型，采用改良的三袖套法吻合技術建立同種異體大鼠左肺原位移植模型[6]。

1.2.3 血氣分析 移植成功后開放血流再灌注4 h，阻斷右肺門5 min，抽頸動脈血做血氣分析。

1.2.4 移植肺W/D測定 取上1/3肺組織稱重，分析天平稱取濕重（W）；隨后置入60℃烤箱中，72 h后重量不再變化時稱取干重（D），計算W/D。

1.2.5 移植肺組織TNF-α及IL-6含量測定 移植肺在冷生理鹽水內漂洗、濾紙吸干黏液，以冷生理鹽水作為勻漿介質，冰浴下以玻璃勻漿器勻漿，4℃，3 500 r/min轉低溫離心15 min取上清。采用ELISA檢測試劑盒測定各組TNF-α及IL-6的表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多個樣本均數的比較采用完全隨機設計資料的單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 移植肺PaO2、PaCO2及W/D比較

與A組比較，B組PaO2下降、PaCO2升高，肺組織W/D值升高；與B組比較，C組的PaO2升高、肺組織W/D值下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 移植肺組織TNF-α及IL-6含量比較

與A組比較，B組移植肺TNF-α及IL-6含量升高；與B組比較，C組移植肺TNF-α及IL-6含量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠肺組織的病理學變化

A組肺泡結構清晰，肺泡腔內無明顯滲出。B組可見肺泡壁結構破壞明顯，有明顯的炎細胞浸潤。C組可見炎細胞浸潤明顯，但與B組比較，肺泡結構依舊比較完整。見附圖。

表1 移植肺PaO2、PaCO2及W/D比較 （±s）

表1 移植肺PaO2、PaCO2及W/D比較 （±s）

注：1）與A組比較，P＜0.05；2）與B組比較，P＜0.05

組別 PaO2/mmHg PaCO2/mmHg W/D A 組 105.75±12.09 15.75±4.62 4.08±1.06 B組 74.25±11.841） 27.00±4.041） 6.98±1.261）C組 91.38±10.502） 22.75±2.672） 5.14±1.302）F值 15.050 17.290 11.742 P值 0.000 0.000 0.000

表2 移植肺TNF-α及IL-6含量比較 （μg/L，±s）

表2 移植肺TNF-α及IL-6含量比較 （μg/L，±s）

注：1）與A組比較，P＜0.05；2）與B組比較，P＜0.05

組別 TNF-α IL-6 A組 98.38±13.04 60.38±14.54 B組 150.25±24.421） 98.63±15.031）C組 126.75±14.772） 77.75±17.522）F值 16.445 11.828 P值 0.000 0.000

附圖 各組大鼠肺組織的病理學變化 （HE ×200）

3 討論

作為治療終末期肺疾病的重要手段，雖然現在供肺的保存與轉運手段取得了巨大進步，同時，肺移植的手術技巧和術后管理水平也得到了不斷提高，但是I/R損傷仍然是肺移植術后難以完美解決的難題，I/R損傷可導致原發性移植肺的功能障礙，同時會帶來諸多并發癥，嚴重者可導致移植肺喪失功能及患者死亡[3]。因此，預防和減輕I/R損傷是肺移植領域十分重要的研究內容。研究顯示，肺移植術后的I/R損傷是眾多細胞因子參與的炎癥損傷過程。I/R過程激活移植肺組織內的單核巨噬細胞和內皮細胞，釋放一系列細胞因子，其中TNF-α及IL-6水平增高，其促進白細胞的趨化、浸潤、聚集、活化和炎癥鏈式反應的發生，參與了受體內中性粒細胞、淋巴細胞等白細胞的游走和活化，攻擊損傷血管內皮，引起器官組織再灌注損傷的病理生理改變。

另外有研究表明，在人體內存在一條抗炎通路即膽堿能抗炎通路（cholinergic anti inflammatory pathway，CAP），它是通過迷走神經及其遞質乙酰膽堿與免疫系統之間的相互作用來參與抗炎作用，是一條神經-免疫調節通路[7]。

α7nAChR就在該通路中起重要作用，它屬于煙堿型乙酰膽堿受體，是由5個α7單體組成的配體門控離子通道，廣泛分布于神經、呼吸、循環、免疫、生殖系統中，對鈣離子有良好的通透性，其參與的病理生理過程都涉及鈣離子的內流。已有研究發現，激活α7nAChR后可以發揮抗炎、抗凋亡、抗氧化、促血管生成等4大作用[8-10]。因此α7nAChR是膽堿能性抗炎通路與炎癥反應之間的關鍵。迷走神經受到刺激后終末傳出支釋放乙酰膽堿，特異性結合于組織巨噬細胞表面的a7nAChR，抑制炎癥細胞因子釋放，從而發揮控制炎癥反應的作用[11-12]。因此，猜測激活a7nAChR可以間接降低肺移植后I/R中TNF-α及IL-6的含量，進而發揮其快速的抗炎作用。

本實驗通過復制同種異體大鼠左肺移植I/R損傷的動物模型，探討α7nAChR激動劑對大鼠移植肺I/R損傷是否具有保護作用及可能機制。通過合理的空白對照研究發現α7nAChR激動劑處理組中的PaO2升高、肺組織W/D值下降同時TNF-α及IL-6的含量降低，其可能的作用機制為α7nAChR激動劑可以通過CAP途徑降低肺移植后體內TNF-α及IL-6的含量，從而抑制I/R過程中炎癥介質的釋放，炎癥介質的減少能夠減輕術后大鼠的肺水腫，降低W/D值，進而改善移植肺的肺功能。這一結果提示α7nAChR激動劑在預防肺移植術后的I/R損傷中具有一定的使用價值。

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