抗菌肽LL-37與膀胱尿路上皮癌關系的初步探討*

朱波，曾琪，潘廣瑞，趙暉

（昆明醫科大學第一附屬醫院 泌尿外科，云南 昆明 650032）

抗菌肽LL-37是人體內固有免疫成員。近來研究表明，其在抗感染、免疫調節、促血管生成、抑癌及促癌等方面均發揮生物學作用[1]。且作為泌尿道重要的天然免疫因子，在從腎盂到膀胱黏膜的上皮中均有表達，并在細菌侵入時迅速合成和分泌，提示其與泌尿系感染密切相關[2]。MICHAUD等[3]發現，慢性炎癥可促進膀胱癌的發生。同時也有研究顯示膀胱癌會被急性炎癥抑制[4]。SUTTMANN等[5]還報道合成抗菌肽天蠶素A、B可抑制膀胱癌的增殖，對良性的纖維母細胞則幾乎沒有影響。這些發現引導筆者聯想到LL-37和膀胱癌間的聯系，該實驗旨在初步探討兩者的關系，為今后研究奠定基礎，以期望為膀胱癌的治療找到一條新的途徑。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

T24、EJ和SV-HUC-1細胞株均購于中國科學院昆明動物研究所細胞庫，LL-37ELISA試劑盒購自荷蘭Hycult公司，LL-37由上海吉爾生化有限公司合成，PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，β-actin多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，兔抗人LL-37多克隆抗體由美國Abcam公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養方法 膀胱癌T24、EJ細胞培養于含10% FBS的RPMI 1640培養基，SV-HUC-1細胞則僅將基礎培養基更換為DMEM高糖，均置于37℃、5%二氧化碳CO2培養箱，每2、3天更換培養液，當細胞匯合度達80%～90%時傳代。

1.2.2 ELISA法檢測尿液、細胞培養液上清中LL-37的水平 2014年1月-2014年6月昆明醫科大學第一附屬醫院膀胱癌患者30例，并隨機選取30例健康志愿者，收集他們的新鮮晨尿后照LL-37檢測試劑盒說明書對樣本進行檢測。將3株細胞以1×105個/ml的密度接種于24孔板，300μl/孔，待細胞匯合度達60%時更換無血清培養液，分別加入1、5和10μg/ ml LPS，各設3個副孔及空白對照組，繼續培養后照LL-37檢測試劑盒說明書對各孔進行測定。

1.2.3 免疫組織化學和RT-PCR檢測膀胱癌組織及其周圍組織LL-37的表達 2014年1月-2014年9月昆明醫科大學第一附屬醫院膀胱癌患者30例，術中取癌組織標本及其周圍1 cm以內的黏膜、肌層組織標本（外觀上無明顯炎癥反應），作為腫瘤組、癌旁組。依據免疫組織化學試劑盒說明書操作，反應后呈棕黃色判定為LL-37陽性。參考文獻[6]設計并合成LL-37引物，正向引物：5'-GATA ACAAGAGATTTGCCCTGCTG-3'，反向引物：5'-TTTC TCAGAGCCCAGAAGCCTG-3'，擴增片段大小為173 bp，內參照β-actin正向引物：5'-CCCATCTATG AGGGTTACGC-3'，反向引物：5'-TTTAATGTCACGC ACGATTC-3'，擴增片段大小為150 bp，均由上海華大基因公司合成。采用Trizol法提取組織總RNA。PCR反 應 體 系：模 板 DNA 1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs 4μl、LL-37正 反 向 引 物 各 0.5μl、ddH2O 15μl、TaqDNA 聚 合酶 0.25μl。PCR 反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，共30個循環，72℃繼續延伸10 min。反應后對PCR反應液行瓊脂糖凝膠電泳以確認RTPCR擴增產物（約173 bp）。若該位置有條帶，則用瓊脂糖凝膠回收并行克隆和測序。最后照PCR試劑盒說明書行RT-PCR反應，結束后確認RT-PCR的擴增和融解曲線及PCR定量時制作的標準曲線。

1.2.4 MTT檢測細胞經LL-37處理的增殖情況將3株細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板，100μl/孔。分別加入22.5、45.0、90.0、180.0和270.0μg/ml LL-37，各設5個副孔及空白對照組。24 h后加入20μl/孔 MTT（5mg/ml），孵育4 h后吸棄孔內培養液，加入150μl/孔 DMSO混勻10 min。酶標儀上測490 nm處吸光度OD值，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）來表示，兩獨立樣本比較用t檢驗，各組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尿液、組織標本及細胞培養液上清中LL-37的表達

2.1.1 膀胱癌患者尿液中LL-37水平 膀胱癌組和健康對照組的LL-37水平分別為（24.32±0.02）和（2.02±0.06）ng/ml，經t檢驗，差異有統計學意義（t=1 931.240，P=0.000），膀胱癌患者尿液中LL-37水平較健康對照組升高。

2.1.2 各組織中LL-37的表達 LL-37在膀胱癌組織中表達陰性，而在癌組織周圍的炎癥細胞、血管壁及平滑肌內卻呈陽性表達。見圖1。

2.1.3 各組織中LL-37的表達 以β-actin的PCR產物條帶亮度作為陽性對照，亮度越高提示LL-37表達越高，可見膀胱癌旁組織中LL-37的表達比癌組織相對較高。見圖2。

經過RT-PCR得出膀胱癌組織和膀胱癌旁組織中LL-37基因表達的Ct值Ct癌、Ct癌旁，分別與內參β-actin的Ct值Ct內參比較，經過公式2ΔCt=2Ct癌/癌旁-Ct內參計算后可見膀胱癌旁組織中LL-37的表達約是癌組織的30倍。見圖3。

2.1.4 細胞培養液上清中LL-37的表達 SVHUC-1、T24、EJ細胞經LPS刺激后細胞培養液上清中LL-37濃度均升高，提示隨著LPS濃度增加，3株細胞中LL-37表達升高。見表1。

2.2 體外LL-37作用后細胞的增殖情況

如表2所示，各濃度LL-37的T24、EJ、SVHUC-1細胞的吸光度值比較，差異有統計學意義（P＜0.05），對T24、EJ細胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈一定劑量依賴性，而LL-37在濃度達270μg/ml時才表現出對SV-HUC-1細胞的抑制作用。

圖1 各組織中LL-37的表達 （免疫組織化學法×100）

圖2 各組織中LL-37的表達

圖3 癌及癌旁組織LL-37的相對表達

表1 細胞培養上清液中LL-37的表達（n=4，ng/ml，±s）

表1 細胞培養上清液中LL-37的表達（n=4，ng/ml，±s）

注：? 與 0μg/ml組比較，P＜0.05

組別 SV-HUC-1 T24 EJ 0μg/ml 8.09±0.12 5.32±1.84 7.53±0.12 1μg/ml 9.41±0.67 20.78±2.84? 7.99±0.55 5μg/ml 41.41±3.28? 50.15±4.07? 10.27±0.59?10μg/ml 54.00±2.89? 62.51±0.54? 13.33±0.34?F值 435.308 389.821 144.225 P值 0.000 0.000 0.000

表2 MTT檢測細胞的吸光度值比較 （n=6，±s）

表2 MTT檢測細胞的吸光度值比較 （n=6，±s）

注：? 與 0.0μg/ml組比較，P＜0.05

T24 EJ SV-HUC-1 0.0μg/ml 0.703±0.0461 0.922±0.0592 0.342±0.0056 22.5μg/ml 0.579±0.0469? 0.773±0.1096? 0.339±0.0096 45.0μg/ml 0.555±0.0229? 0.708±0.0939? 0.336±0.0077 90.0μg/ml 0.541±0.0331? 0.576±0.0485? 0.329±0.0104 180.0μg/ml 0.505±0.0236? 0.413±0.0311? 0.330±0.0061 270.0μg/ml 0.384±0.0239? 0.226±0.0664? 0.289±0.0074?F值 54.720 83.360 35.830 P值 0.000 0.000 0.000組別

3 討論

近年來研究顯示，LL-37與腫瘤的關系很微妙，其可抑制胃癌、結腸癌細胞的增值，又能促進乳腺癌、卵巢癌、肺癌的生長[7]，更值得一提的是LL-37可在同一腫瘤中表現為抗癌和促癌作用。VON等[8]發現，20～30 ng/ml LL-37可促進肺癌細胞的增值，而將其濃度調為20μg/ml后癌細胞的數量明顯減少。LI等[9]發現，腫瘤微環境中的免疫細胞分泌的Cathelicidin類抗菌肽可促進結腸癌細胞生長；與REN等[10]的研究結論不同之處也在于其所用的LL-37濃度為生理水平甚至更低，用于人、鼠結腸癌細胞的各為1μg/ml、100 ng/ml，而文獻中LL-37的濃度為20～60μmol/l。由此可見LL-37濃度的差異對腫瘤的影響。

該實驗中LL-37在膀胱癌患者尿液中的濃度較健康志愿者高，那么這一升高的LL-37來源于何處呢？結合免疫組織化學法結果來看，LL-37主要表達在癌組織周圍的平滑肌、炎癥細胞及血管壁等處，而在癌組織中表達陰性，提示這一升高的LL-37很可能來自于這些癌旁組織或者說是腫瘤細胞生長微環境中的炎癥細胞等分泌。且最近有研究表明，胰腺導管腺癌微環境中的LL-37在胰腺腫瘤干細胞介導的腫瘤發生中起著關鍵性的作用[11]。也有研究發現，髓細胞表達的鼠同源Cathelicidin抗菌肽CLAMP可通過募集炎癥細胞促進肺癌的生長，且腫瘤細胞會分泌可溶性因子誘導巨噬細胞中LL-37的表達，提示LL-37、炎癥和腫瘤有著密切的聯系[12]。朱小丹等[13]在體外將巨噬細胞和卵巢癌細胞共同培養以構建簡化的腫瘤微環境模型時，也發現巨噬細胞可通過增強抗菌肽LL-37的表達和分泌促進卵巢癌細胞的增殖。這些研究提示，腫瘤微環境中LL-37的存在及其對腫瘤的影響。該研究發現，膀胱癌組織的微環境中有明顯的LL-37表達，且經LPS刺激后膀胱癌細胞培養液上清中也有其濃度的升高，提示這些濃度范圍內的LL-37對膀胱尿路上皮癌是沒有害處的。然而，當在體外使用22.5～270μg/ml LL-37時，其可抑制膀胱癌細胞的增殖，而對正常尿路上皮細胞的抑制作用則不明顯，表明在一定的濃度范圍內LL-37對腫瘤細胞的殺傷作用更大。同時研究表明，多西他賽搭載LL-37后的溫敏凝膠顆粒可提高對大腸癌腹膜轉移癌的抗癌效果，提示治療腫瘤時可聯合使用LL-37[14]。對于該研究中提示的體內外LL-37的不同作用，筆者認為和前述的LL-37在同一腫瘤中表現為抗癌和促癌一樣，是由濃度的差異所引起的。

另外，有學者在探討LL-37對卵巢癌的作用時，采用基因芯片技術對LL-37在膀胱癌的表達也進行檢測，結果顯示，1例膀胱癌組織中有明顯的LL-37表達，這可能是由于其在采集腫瘤組織標本中的同時也包含了膀胱平滑肌、血管等組織，且只有1例，而與該實驗結果有出入[15]。而最新研究結果顯示，膀胱癌細胞可通過分泌LL-37來抑制BCG的內化，在加入LL-37抗體后，BCG的抗腫瘤效應又明顯增強，提示一定濃度的LL-37可能更適應膀胱腫瘤的生長，這在某些方面上與該研究結論有著相似之處[16]。然而，該研究中關于LL-37和膀胱尿路上皮癌的探討還僅限于初級階段，尚需后期進一步實驗來闡釋兩者間復雜的關系。

該研究通過LPS刺激可誘發T24、EJ和SVHUC-1細胞分泌LL-37，表明除了正常尿路上皮細胞，膀胱尿路上皮癌細胞同樣可以產生LL-37。同時，筆者還發現膀胱腫瘤細胞微環境中存在著一定濃度的LL-37，提示其可能在腫瘤的發病中起到一定作用，然而是腫瘤細胞促進LL-37的產生，還是LL-37誘導腫瘤的發生，尚需進一步證實。且該研究中僅檢測30例膀胱癌患者的腫瘤組織標本，樣本數不是很大，但其還是在一定程度上提示LL-37與膀胱尿路上皮癌的相關性。另外，體外高濃度的LL-37可抑制膀胱癌T24、EJ細胞的增殖。

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