老年晚期非小細胞肺癌外周血RRM1表達與吉西他濱療效及預后的相關性研究*

江波，朱穎，涂長玲，何文杰，聶俊，楊承綱

[昆明醫科大學第三附屬醫院（云南省腫瘤醫院）1.干部醫療科，2.病理科，云南 昆明 650118]

無驅動基因的晚期NSCLC的一線標準化療方案目前仍然是鉑類為基礎的雙藥方案。既往臨床實踐提示：在化療方案及藥物劑量相同的情況下，不同個體對化療的敏感性差異很大，這種差異使依靠臨床經驗進行化療面臨著極大的挑戰。老年人是個特殊群體，器官功能與藥物代謝和年輕人不同，臨床中有很多老年患者因化療療效的不確定性和毒副反應的不可避免性而選擇放棄治療。DNA是許多抗腫瘤藥物的分子靶點，DNA的修復能力影響著化療藥物的療效，也和化療藥物的耐藥性相關。為了提高藥物的療效，減輕毒副反應，可以通過對化療藥物相關基因或蛋白的表達水平或多態性進行檢測，篩選出能夠從化療中獲益的老年人群，從而提高療效，減低毒副反應?，F階段定量分析RRM1表達水平的研究主要針對來源于纖維支氣管鏡活檢或手術切除獲得的腫瘤組織，而對于老年晚期患者來說，組織標本無法再次獲取或者組織量較少的問題尤為突出。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測老年晚期NSCLC患者外周血中RRM1的表達與吉西他濱化療藥物療效及預后的相關性，旨在尋找一種簡便易行的檢測方法進行化療藥物的篩選。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

篩選云南省腫瘤醫院2013年9月-2015年12月收治且經病理組織學診斷的晚期NSCLC患者40例，其中，男性32例，女性8例，男∶女為4∶1，年齡70～78歲，平均73歲，PS評分≤2分。病理類型：鱗癌30例，均未行EGFR突變檢測；腺癌10例，其中6例EGFR野生型，4例EGFR突變未知型。Ⅲb期8例，Ⅳ期32例?；熐靶蠧T，彩超和全身骨骼核素掃描，常規檢查心、肺、肝、腎等功能?；煵捎眉魉麨I單藥的化療方案：吉西他濱1 000 mg/m2第1和8天，每21～28 d為1個周期；連續2～6個周期。病理組織分型按WHO組織學分類（1998）標準，分期按1997年國際抗癌聯盟（UICC）制訂的標準。

1.2 試劑和儀器

外周血中RNA提取試劑盒，cDNA合成試劑盒，熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技公司。PCR儀，凝膠成像系統由北京BioRAD公司生產。

1.3 引物設計和合成

根據GeneBank的序列RRM1及管家基因β-actin進行引物設計。RRM1正向引物：5'-CCCTGACTATG CTATCCTGGC-3'，反向引物：5'-ACCATGGGAGAGTG TTTGCC-3'；管家基因正向引物：5'-AGCCTCGCCTTTG CCG-3'，反向引物：5'-CTCGTCGCCCACATAGGAAT-3'。引物由北京Invitrogen公司合成。

1.4 外周血中RNA的提取及cDNA的合成

在化療前和2個周期化療后分別抽取患者外周靜脈血4 ml置于EDTA抗凝管中，離心后棄去上層血漿，將細胞層移入離心管中。依據血液RNA提取試劑盒操作規程進行外周血中RNA的提取。依據cDNA合成試劑盒操作規程進行cDNA的合成反應。

1.5 qRT-PCR

將質粒標準品RRM1及管家基因質粒標準品等比稀釋成6個濃度后，進行SYBR qRT-PCR。反應體系中加入Real Master Mix/SYBR Solution 22.5μl，正反向引物各 1μl，Rox reference dye 0.5μl，DNA 模板5μl，DEPC水20.5μl。反應條件：聚合酶的活化20 s，95℃，PCR擴增40個循環。

1.6 療效判斷標準

療效按WHO實體瘤標準判定分為：完全緩解（complete response，CR），部分緩解（partial response，PR），疾病穩定（stable disease，SD）， 疾 病進展（progression disease，PD）。CR+PR為有效，CR+PR+SD為控制。無進展生存期（progression free survival，PFS）指自治療首日至病變進展日；總生存期（overall suvvival，OS）為治療首日至死亡日或失訪日，均以月計。隨訪結止時間：2016年4月。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。進行統計處理前，治療前外周血RRM1的表達以其中位數為界，分為高表達組和低表達組。2個樣本率的比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法、Logrank法檢驗及Cox多因素回歸分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血RRM1及管家基因的電泳結果

以含有RRM1和管家基因的質粒作為模板進行PCR擴增，產物經瓊脂凝膠電泳檢測，條帶清晰，片段長度正確，經測序證實兩序列一致。見圖1。

圖1 外周血中RRM1不同表達水平的電泳結果

2.2 外周血RRM1的表達水平

以管家基因β-actin作為內參，計算RRM1的相對表達量。計算方法：RRM1mRNA拷貝數/β-actin mRNA拷貝數，計算平均值。外周血中RRM1的中位表達水平為：26.7%（12.32%～55.86%）。

2.3 外周血RRM1表達與臨床特征的關系

外周血RRM1的表達水平以中位數26.7%為界分為高表達組和低表達組。高表達組的表達水平為：（51.65%±4.21%）；低表達組的表達水平為：（15.33%±3.01%）。兩組與臨床特征的相關性見表1。

表1 外周血RRM1表達與臨床特征的相關性

2.4 外周血RRM1表達與化療療效的關系

本組患者共接受單藥吉西他濱方案化療146周期，無CR患者，9例PR，總有效率（CR+PR）為22.5%，8例SD（20%），疾病控制率（CR+PR+SD）為42.5%，23例PD（57.5%）。RRM1低表達組有效率（RR）40%（8/20），RRM1 高表達組有效率 5%（1/20），兩組差異有統計學意義（P=0.023）。RRM1低表達組疾病控制率（disease control rate，DCR）65%（13/20），RRM1高表達組疾病控制率20%（4/20），兩組差異有統計學意義（P=0.004），見表2。

表2 外周血RRM1表達水平與化療療效的關系 （n=20）

2.5 外周血RRM1表達與生存期的關系

本組病例中位總生存期（OS）為13.3個月，1年生存率為66.7%，2年生存率為4.6%。RRM1低表達組和高表達組，中位OS分別為14.8個月和11.6個月，1年生存率分別為76.7%和53.3%；2年生存率分別為9.3%和0%。經Log-rank檢驗，差異有統計學意義（P=0.004），見圖1。OS與性別（男：13個月vs女：15個月，P=0.052）、病理類型（鱗癌：14個月vs腺癌：14.5個月，P=0.139）、分期（ⅢB期：13.2個月vsⅣ期：14.5個月，P=0.148）均無相關性。

本組病例中位無進展生存期（PFS）為3.7個月。RRM1低表達組和高表達組，中位PFS分別為4.4個月和3.2個月；經Log-rank檢驗，差異有統計學意義（P=0.012）。見圖2、圖3。

圖2 外周血RRM1表達水平與生存期的關系

2.6 晚期NSCLC預后的Cox多因素分析

將OS單因素分析中有統計學意義的變量納入多因素分析時，Cox回歸分析顯示：RRM1表達是有統計學意義的預后因素，見表3。

圖3 外周血RRM1表達水平與無進展生存期的關系

表3 Cox回歸變量分析

3 討論

已有研究[2-4]提示：吉西他濱用于腫瘤細胞時，RRM1的表達水平增高會使腫瘤細胞的耐藥性增加。既然晚期NSCLC患者中RRM1的表達水平與腫瘤細胞對吉西他濱耐藥的相關性已經明確，RRM1的表達水平應該可以成為篩選患者的一項指標。多項Meta分析[5-7]提示：RRM1低表達的患者對吉西他濱化療更敏感，生存期也更長；RRM1的表達可預測吉西他濱化療的療效。ZHANG等[8]的研究同時檢測了外周血中RRM1和ERCC1的表達，發現外周血RRM1低表達的患者比RRM1高表達的患者有更高的化療有效率和更長的無進展生存期及總生存期；而外周血ERCC1的表達水平與吉西他濱和鉑類化療的療效及生存期無相關性。從現有的標本來看，外周血中的表達檢測相對簡便而且容易獲取，對于無法獲取組織及組織標本量較少的老年患者來說，外周血替代組織標本檢測是可行的。

本研究以老年晚期NSCLC為研究對象，化療藥物選擇單藥吉西他濱，排除了鉑類藥物的影響因素，使研究因素較為單一，因此能較好地反應外周血RRM1的表達與吉西他濱療效間的關系。研究顯示：外周血RRM1的表達水平與老年晚期NSCLC患者的性別，病理類型及分期均無相關性。外周血RRM1低表達的患者比RRM1高表達的老年患者有更高的化療有效率，疾病控制率和更長的無進展生存期及總生存期，說明老年晚期NSCLC外周血RRM1低表達的患者更能從吉西他濱的化療中獲益。而生存期與老年患者的性別，分期，病理類型無明顯的相關性。多因素分析還顯示外周血RRM1的表達水平是老年晚期NSCLC獨立的預后因素。通過本項研究為晚期NSCLC無法再獲取組織標本的老年患者如何選擇化療藥物提供了理論依據。

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