聯合監測血清AFP-L3與HBV DNA在診斷肝硬化癌變中的價值

王瑜，王志軍

（1.河南科技大學附屬安陽市第五人民醫院 檢驗科，河南 安陽 455001；2.河南省安陽市人民醫院 普外科，河南 安陽 455000）

乙 型 肝 炎 病 毒（hepatitis B virus，HBV） 的復制與乙型肝炎肝硬化癌變關系密切；甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是一種糖蛋白，依據對小扁豆凝集素（lens culinaris agglutinin，LCA）親和電泳的反應性，AFP可以被分為3種異質體：L1、L2及L3，AFP-L3與小扁豆凝集素高親和力，僅由腫瘤細胞產生。為了解乙型肝炎肝硬化癌變患者HBV復制狀況以及AFP-L3的表達情況及其診斷價值，本研究對66例乙型肝炎肝硬化癌變和71例乙型肝炎肝硬化患者的血清HBV DNA及AFP-L3進行了聯合檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年10月-2015年8月在安陽市第五人民醫院就診資料完整的門診及住院患者，其中66例乙型肝炎肝硬化癌變（肝硬化癌變組）和71例乙型肝炎肝硬化（肝硬化組）。肝硬化癌變組均經臨床、影像及病理學確診，原發性肝癌的診斷標準參照中華人民共和國衛生部頒發的2011年版《原發性肝癌診療規范》[1]，其中，男39例，女27例；年齡33～76歲（中位數55歲）；均有乙型肝炎肝硬化病史8～26年（中位數19年）。肝硬化組中，男53例，女18例；年齡20～76歲（中位數49歲）；病程6～21年（中位數13年）；診斷標準符合2000年全國傳染病與寄生蟲病學術會議診斷標準[2]。經統計學分析顯示，兩組之間在性別、年齡、乙型肝炎肝硬化病史等方面差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑及儀器

AFP-L3和總AFP檢測采用化學發光免疫分析法，所用Maglumi 2000 plus全自動化學發光測定儀及配套試劑購自深圳市新產業生物工程股份有限公司，AFP-L3親和吸附離心管購自北京熱景生物技術有限公司。HBV DNA定量測定采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）進行檢測，檢測試劑盒由廈門安普利生物工程有限公司提供，使用美國AMI公司生物PE2400擴增儀。

1.3 操作方法

1.3.1 HBV DNA定量測定 ①提取核酸：血清標本50μl加入等量提取液并震蕩混勻，吸取前吹打以便吸取固體沉淀顆粒物；瞬時離心后，100℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心10 min，留取上清液。②qRT-PCR檢測：配制PCR反應液（35.6μl HBV反應混合液+0.4μl Taq 酶），每管分別加入2μl待測樣本、陽性對照和陰性對照，混勻后瞬時離心，置入qRT-PCR儀中，以95℃ 3 min、94℃ 15 s、60℃ 30 s進行40個循環的擴增，收集FAM、HEX通道熒光信號，記錄檢測結果。HBV DNA＞5.00+2Ecopies/ml為陽性。

1.3.2 AFP-L3分離 首先取患者血清400μl加入600μl清洗液中混勻。親和吸附離心管的上部離心管置入離心外管，以3 000 r/min離心20 s去除保護液，吸取稀釋后的血清600μl加入上部離心管中，室溫下放置10 min；加入清洗液1.2 ml，也以3 000 r/min離心20 s，丟棄上清液。而后加入600μl洗脫液，同樣3 000 r/min離心20 s，收集離心柱外管中的液體，即為含AFP-L3的樣本；用電化學發光法檢測總的AFP和AFP-L3的含量，計算AFP-L3占AFP總量的百分比。以2005年美國FDA設定的AFP-L3/AFP＞10%作為陽性判斷標準。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0軟件進行統計分析，AFP-L3及HBV DNA陽性率采用χ2檢驗。AFP-L3及HBV DNA的一致性檢驗采用Kappa評價，判斷標準為Kappa值≤0.40，說明一致性較差；0.40＜Kappa值＜0.75，說明一致性一般；Kappa值≥0.75，說明有較好的一致性。敏感性=真陽性人數/（真陽性人數+假陽性人數）×100%；特異性=真陰性人數/（真陰性人數+假陰性人數）×100%。

2 結果

2.1 兩組AFP-L3及HBV DNA陽性率比較

兩組血清AFP-L3陽性率分別為74.2%（49/66）和9.9%（7/71），兩組比較，差異有統計學意義（χ2=58.667，P=0.000），肝硬化癌變組高于肝硬化組；兩組血清HBV DNA陽性率分別為59.1%（39/66）和33.8%（24/71），兩組比較，差異有統計學意義（χ2=8.806，P=0.003），肝硬化癌變組高于肝硬化組。

2.2 兩組血清AFP-L3及HBV DNA結果的一致性比較

兩組AFP-L3與HBV DNA結果總符合率為87.6%（120/137）；兩組結果的一致性檢驗采用Kappa評價，Kappa=0.748，說明2種方法吻合程度一般。見表1。

表1 血清AFP-L3及HBV DNA的一致性比較 例

2.3 血清AFP-L3及HBV DNA聯合檢測對肝硬化癌變診斷的效能比較

AFP-L3與HBV DNA并聯診斷肝硬化癌變的敏感性與單獨檢測AFP-L3比較，差異有統計學意義（χ2=6.371，P=0.012），并聯診斷高于單獨檢測；兩者串聯診斷肝硬化癌變的特異性與單獨AFP-L3檢測比較，差異無統計學意義（χ2=0.132，P=0.716）。見表2。

表2 血清AFP-L3及HBV DNA單獨/聯合檢測對肝硬化癌變診斷的效能比較 %

3 討論

AFP是一種腫瘤相關的糖蛋白，依據對LCA親和電泳的反應性，AFP可以被分為3種異質體：L1、L2及L3，AFP-L1不與LCA反應存在于慢性肝炎和肝硬化中，構成非惡性肝病中總AFP的主要部分；AFP-L2與LCA有中度親和力，主要來源于卵黃囊腫瘤，在懷孕期間在母體的血清中也可以檢測到[2]；AFP-L3與LCA高親和力結合，它是一種異常糖基化的AFP，僅由腫瘤細胞產生，近年來被FDA批準用于原發性肝癌的臨床輔助診斷，第四屆全國肝癌學術會議也將AFP-L3定為原發性肝癌的診斷標記物之一。

本研究表明，肝硬化癌變組AFP-L3的陽性率高于肝硬化組，兩組之間差異有統計學意義。JIA等[3]的研究發現，肝癌患者AFP-L3陽性率為75.5%（77/102）與本組結果基本相符。多項研究表明[4-6]，即使AFP水平較低的患者，AFP-L3也有較高的表達，AFP-L3對于AFP陰性的早期肝癌也是良好的標記物。AFP-L3具有較高的特異性，可用于肝癌患者術后的隨訪。AFP-L3如果術后不能轉陰，往往提示預后不良[7-8]。

HBV感染是HCC發生的危險因素之一，HBV DNA高復制狀態常被認為是發生HCC的高危因素。多因素分析表明，乙型肝炎肝硬化患者HBV DNA陽性是肝癌發生的危險因素[9]。一項長達14年的關于乙型肝炎病毒載量與肝癌發病風險的前瞻性研究發現[10]，HBV DNA是啟動肝癌重要的預警因子，癌變患者HBV DNA陽性率達80.5%（70/87）。也有研究表明[11]HBV DNA的載量越高發生肝癌的危險性越高。本組中癌變患者HBV DNA陽性率也高于肝硬化患者。

AFP-L3及HBV DNA檢驗結果具有一定程度的一致性（Kappa值=0.748，雖沒有達到0.75，但也十分接近），說明兩者有一定的關聯，均可以作為乙型肝炎肝硬化癌變的重要標志物。本研究表明，AFP-L3及HBV DNA并聯檢測的敏感性高于單獨檢測AFP-L3及HBV DNA，2指標并聯檢測敏感性的升高，能有效地避免部分AFP-L3陰性或HBV DNA陰性患者的漏診，用于原發性肝癌的早期篩查具有很高的臨床應用價值。與單獨檢測AFP-L3相比，兩者的串聯檢測的特異性沒有明顯提高，說明單獨檢測AFP-L3對于乙型肝炎肝硬化癌變患者診斷有較高的準確率。

AFP-L3及HBV DNA檢驗結果具有一定程度的一致性，均可以作為乙型肝炎肝硬化癌變的重要標志物。AFP-L3及HBV DNA并聯檢測能夠提高診斷乙型肝炎肝硬化癌變敏感性，可以有效地減少癌變患者的漏診。

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