煙草煙霧暴露對氣道上皮細胞轉分化改變的初探

李雯曦

【摘要】 目的：觀察煙草煙霧暴露人氣道上皮細胞（16HBE）后，發生間充質轉分化（EMT）樣改變。方法：（1）以不同濃度（5～50 μg/mL）CSC刺激16HBE 7 d，用CCKit-8檢測細胞總體活性，篩選最佳濃度。（2）用CSC最大活性影響濃度刺激16HBE 7 d，觀察細胞形態改變，經Western-blot法和細胞免疫熒光技術檢測上皮細胞標志物E鈣黏蛋白（E-cad）及EMT標記物1型膠原（COL1）、波形蛋白（Vimentin）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達水平。結果：（1）不同濃度CSC刺激后，16HBE在

10 μg/mL時OD值最高，為（2.562±0.045）。各濃度間OD值比較差異均有統計學意義（P<0.05）。（2）經10 μg/mL CSC刺激后，部分16HBE形態由鵝卵石狀向長梭形、多角形或星形改變。（3）Western-blot檢測發現試驗組COL1、MMP-9的蛋白表達量分別為（0.566±0.011）和（0.463±0.003），高于對照組（0.272±0.020）和（0.201±0.023），差異均有統計學意義（P<0.05）；而E-cad蛋白表達量則明顯低于對照組，分別為（0.301±0.041）和（0.591±0.068），差異有統計學意義（P<0.05）。（4）細胞免疫熒光檢測發現試驗組COL1、Vimentin和MMP-9蛋白表達量均高于對照組（P<0.05）；而E-cad蛋白表達量明顯低于對照組（P<0.05）。結論：經CSC刺激后，16HBE可出現轉分化樣改變。

【關鍵詞】 煙草煙霧凝集物； 氣道上皮細胞； 上皮細胞間充質轉分化

【Abstract】 Objective：To observe the epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells（16HBE） exposed to cigarette smoke.Method：Cells were stimulated by cigarrette smoke condensate（CSC） with different concentrations（5-50 μg/mL） for 7 days，then chosen the optimal concentration by cell counting kit-8.Western blot and Immunofluorescence method were used to estimate the expression levels of E-cad，type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 in 16HBE induced with CSC （10 μg/mL） for 7 days.Result：16HBE manifested a morphological characteristic of loss of cell-cell contact and elongated shape，after 7 days induced with CSC.The level of E-cad downregulated in the experimental group[Western blot（0.301±0.041） vs （0.591±0.068），P<0.05].In contrast，upregulations in expression of type 1 collagen[Western blot （0.566±0.011） vs （0.272±0.020），P<0.05] and MMP-9[（0.463±0.003） vs （0.201±0.023），P<0.05] were observed in the presence of the experimental group，compared with the control group.Immunofluorescence analysis showed that after a 7-day exposure to CSC，E-cad protein was lost whereas type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 proteins were acquired.Conclusion：CSC exposure can induce EMT-like process in human airway epithelial cells.

【Key words】 Cigarette smoke condensate； Bronchial epithelial cell； Epithelial-mesenchymal transition

First-authors address：Guangzhou First Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.008

氣道重塑是慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的主要病理特征和引起不可逆性氣流受限的主要原因之一[1]，其中上皮間充質轉分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）與氣道重構密切相關[2]，EMT通過使氣道壁中的成纖維細胞增加，從而參與氣道重構。吸煙是公認的導致COPD發病和不可逆氣流受限進展的最為重要的致病因素[3]。最近研究發現，香煙煙霧凝集物（Cigarette Smoke Condense，CSC）能誘導人氣道上皮細胞（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）發生類似EMT的改變[4]。由此推斷，EMT可能是吸煙致COPD氣道重構的重要機制之一。CSC可能經由EMT獲得成纖維細胞樣表型，促進氣道重構的發生發展。因此，本研究將16HBE暴露于CSC后，通過觀察其對16HBE細胞形態的影響及其EMT相關標志物表達的改變，為EMT在煙草煙霧暴露致COPD氣道重構中的可能作用進行初步研究。現報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗材料 采用由廣州醫學院實驗中心提供的人正常氣道上皮細胞株（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）。美國GIBCO公司生產的DMEM細胞培養液、胎牛血清（FBS）。日本同仁化學研究所生產的細胞計數試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCKit-8）試劑。Western blot發光試劑盒為美國Millipore公司產品，GAPDH兔源性多克隆抗體購于美國Biovision公司，E-cad、COL1及MMP-9抗體購自美國SantaCruz公司，Vimentin抗體和核染色液DEPI為Sigma公司產品，辣根酶標記山羊抗鼠IgG二抗及辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗均購于北京華肽先鋒生物科技公司，Alexa Fluor488標記（綠色熒光）羊抗小鼠IgG工作液及Alexa Fluor594標記（紅色熒光）羊抗兔IgG工作液均購自美國生命公司。

1.2 實驗分組 將實驗分成兩組，對照組和實驗組。對照組為未經任何處理的16HBE，實驗組即CSC刺激組。各組實驗至少重復3次，取其平均值。

1.3 實驗方法

1.3.1 CSC的制備 用于CSC制備的香煙由紅云紅河煙草有限公司生產，長為84 mm，直徑為8 mm，焦油含量12 mg/支，煙堿含量1.2 mg/支。將內附玻璃纖維濾膜（Cambridge filter pad，其粗糙面朝向過濾嘴一端）的過濾器兩邊連上膠管，一端連接一支香煙后點燃，另一端接上60 mL注射器。將吸入的煙霧有規律地推進過濾器和注射器。一共抽吸2支香煙，每支煙吸5 min，負壓吸引。抽吸完畢，卸下膜置于皿中，用1 mL移液槍將100%DMSO滴加于膜上，溶解凝聚物，滴加后搖晃25 min，用槍頭將溶解液吸盡，所得溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，移入離心管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，用1 mL的100%DMSO重懸后稱重（重懸前已稱得1 mL的100%DMSO質量），溶解前后DMSO質量相減，得出溶解后凝集物的質量（g）。把凝集物溶液配成10 mg/mL作為CSC原液，分裝，置于-80 ℃保存，備用。

1.3.2 CCKit-8法檢測細胞活性 進行干預前將細胞接種于96孔培養板中，接種密度為1.5×104個/孔，使得次日進行干預時細胞融合達60%。24 h后，將細胞用磷酸鹽緩沖液洗2次，分別加入不同濃度的CSC后繼續培養7 d。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，然后向培養板加入CCK8溶液（10 μL/每孔），放入5%CO2和37 ℃飽和濕度培養箱內培養4 h后取出，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測量各孔的光吸收值（OD值）。根據各個孔的OD值，計算細胞活性（%），細胞活性（%）=（實驗組OD均值-空白孔OD均值）/（對照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。OD值的測量精度為小數點后三位，按單因素方差分析法進行統計分析。

1.3.3 EMT有關指標檢測 干預前24 h將細胞接種于6孔板中，接種密度為1×105個/孔，使得次日進行干預時細胞融合達60%。加入10 μg/mL的CSC繼續培養7 d。Western-blot法測定：收集細胞提取蛋白，蛋白定量后，以20 μg/孔上樣，將樣本經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離膠進行分離后，將膠轉印至硝酸纖維素膜上。轉膜結束，條帶放入3%脫脂奶粉TBST（1%的Tween20-Tris緩沖液）中，放置搖床1 h即封閉結束。加入一抗前先按比例稀釋，小鼠抗人E-cad和兔抗人COL1按1∶1000用3%BSA稀釋，小鼠抗人MMP-9按1∶500用3%BSA稀釋，內參兔源性多克隆抗體GAPDH按1∶10 000用3%BSA稀釋，然后孵育4 ℃過夜。一抗孵育結束，室溫下用TBST洗4次，每次5 min，再用TBS洗1次，每次

5 min。加二抗（辣根酶標羊抗鼠IgG，1∶10 000或辣根酶標羊抗兔IgG，1∶10 000）室溫下孵育40 min，TBST和TBS洗如前，化學增敏發光法顯影。應用Image J軟件圖像分析系統獲得各條帶光密度值，蛋白質的相對含量以目的蛋白與內參條帶光密度的比值表示，按計量資料進行統計分析。細胞免疫熒光技術檢測法：將細胞接種于12孔板，刺激7 d后，將細胞取出，用PBS液洗3次，加入1∶1甲醇丙酮混合液，室溫下20 min，然后用PBS洗3次，每次5 min，加入0.5%的Triton X-100，室溫10 min；加入5% BSA液室溫30 min后，吸盡BSA封閉液，分別滴加稀釋一抗即小鼠抗人E-cad抗體（1∶50）、兔抗人COL1抗體（1∶100）、小鼠抗人Vimentin抗體（1∶50）及小鼠抗人MMP-9抗體（1∶200），

-4 ℃過夜。陰性對照組用PBS液代替上述一抗進行反應。用0.5%的Triton X-100于脫色搖床上沖洗細胞6次，每次5 min后，加入Alexa Fluor488標記（綠色熒光）羊抗小鼠IgG工作液（1∶250）或Alexa Fluor594標記（紅色熒光）的羊抗兔IgG工作液（1∶250），避光條件下室溫40 min。0.5%的Triton X-100洗同前，加入稀釋核染色液DEPI（1∶1000），室溫15 min，避光。0.5%的Triton X-100洗3次，每次5 min，取作好標記的干凈普通載玻片，其上滴加抗熒光淬滅劑（Invitrogen公司）10 μL，小心夾出爬片，細胞面朝下置于有抗淬滅劑的載玻片上，

-4 ℃避光過夜。運用Axio Imager Z2顯微掃描分析系統，在400倍高倍鏡視野下進行觀察。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，各組實驗至少重復3次，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 不同梯度濃度CSC刺激下16HBE細胞活性檢

測 實驗第一步：首先從較寬濃度（5×10-3～50 μg/mL）

篩選出對細胞有效影響范圍濃度。由表1可見，CSC在5 μg/mL對16HBE細胞有明顯促增殖作用（F=274.61，P<0.05），在50 μg/mL對其活性有顯著抑制作用（F=94.10，P<0.05），因此進一步細化有效刺激濃度，范圍在5～50 μg/mL，刺激7 d后再行CCKit-8檢測。實驗第二步：從細化后的有效刺激濃度篩選出最佳刺激濃度。由表2可見，CSC在10 μg/mL時OD值達到峰值（F=122.69，P<0.05），在此峰值以后OD值下降（F=298.65、445.28、401.18，P<0.05），故將10 μg/mL作為最佳刺激濃度用于后續實驗研究。

2.2 CSC刺激后16HBE形態學檢測 經倒置顯微鏡下觀察，對照組16HBE呈現上皮細胞典型的鋪路石狀形態，細胞間緊密連接，其形態是立體的，稍微凸起的，見圖1；而經10 μg/mL CSC刺激7 d后，16HBE細胞間連接明顯減少，部分細胞形態發生改變，變為長梭形、多角形或星形，見圖2（刺激組中選取EMT樣改變最典型區域）。

2.3 CSC刺激后EMT相關標志物表達 Western blot法檢測，由表3及圖3可見：10 μg/mL 實驗組E-cad蛋白表達量（0.301±0.041）較之對照組（0.591±0.068）明顯減低，差異有統計學意義（F=0.462，P<0.05）；COL1蛋白表達量（0.566±0.011）較之對照組（0.272±0.020）明顯增高，差異有統計學意義（F=0.622，P<0.05）；MMP-9蛋白表達量（0.463±0.003）較之對照組（0.201±0.023）明顯增高，差異有統計學意義（F=2.974，P<0.05）。

2.4 CSC刺激后EMT相關標志物表達細胞免疫熒光技術檢測 由圖4～11可見：16HBE細胞經10 μg/mL

CSC刺激后，與對照組相比，E-cad蛋白表達量減少（綠色熒光在胞膜著色減少），COL1蛋白表達量增加（紅色熒光在胞漿著色增加），Vimentin蛋白表達量增加（綠色熒光在胞漿著色增加），MMP-9蛋白表達量增加（綠色熒光在胞漿著色增加）。

3 討論

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種具有氣流受限特征的可以預防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進行性發展。氣道重構（Airway Remodeling）是COPD主要病理特點之一，結果可引起氣道阻塞和肺的彈性回縮力下降，在氣流受限中扮演非常重要的角色。COPD氣道重塑的特征包括鱗狀和杯狀細胞的化生、黏液腺的肥大和上皮下的纖維化，其中以纖維化為最主要病變[5]。

吸煙已被公認為COPD發病的一個重要危險因素。一般認為，煙草煙霧進入氣道后首先引起氣道上皮的防御反應，導致許多炎癥細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞、CD8+T細胞、上皮細胞等）的集聚活化，并通過自分泌和旁分泌方式釋放各種細胞因子、炎癥因子和介質和蛋白酶作用于氣道結構細胞，引起氣道結構細胞的形態和功能的變化。最近研究指出，在吸煙的COPD患者中，其氣道網狀基底膜斷裂較之不吸煙的正常對照更為明顯，上皮細胞穿過斷裂的基底膜并分化成為肌纖維細胞[6]，然而關于CSC通過何種機制誘導上皮細胞發生纖維化，從而參與COPD氣道重構的研究甚少。

上皮間充質轉化（EMT）是指在胚胎發育、腫瘤轉移或組織纖維化過程中發生的上皮細胞脫黏附而轉變成具遷移能力的間質細胞的現象[7-9]。其病理變化主要包括破壞后缺陷的上皮修復、過多的纖維細胞和肌纖維母細胞，膠原的過度產生和纖維化的發生[10]。EMT作為COPD氣道重塑的重要機制之一，近年來越來越受到重視[11-14]。其與肺纖維化關系密切，是肺纖維化局部成纖維細胞的重要來源[15]。由于EMT，上皮細胞轉化為活動的成纖維細胞，進一步發展成為肌成纖維細胞，使纖維細胞數量增加[2]，從而參與氣道重構。最近報道指出，CSC能誘導人氣道上皮細胞發生類似EMT的改變[4]。體外實驗證實，在CSC刺激下，A549（人肺腺癌細胞）能夠呈現轉分化表型[16]。最近研究報道，香煙煙霧提取物可誘導正常人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）發生EMT[17]。由此推測，CSC可能誘導人氣道上皮細胞發生EMT樣改變，從而使氣道上皮細胞獲得成纖維細胞樣表型，促進氣道重構發展。因此，EMT可能是吸煙致COPD氣道結構重構的重要機制之一。

正常的上皮細胞表型具有結構和功能上的極性，細胞之間緊密連接，其中E鈣黏蛋白（E-cadherin）是粘附連接的主要成分，特別是上皮細胞的連接[18]。在EMT過程中，細胞與細胞間接觸減少，細胞的連接被拆卸，E鈣黏蛋白從細胞連接中移位，表達減少，F-肌動蛋白和β-連環蛋白連接減少，細胞角蛋白丟失，出現間充質和肌成纖維細胞特有標志如波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白等[19]。在纖維化過程中，細胞外基質（ECM）形成和降解的生理學平衡被打亂，與基質流動和生長因子激活有關的基質金屬蛋白酶（如MMP-2、MMP-9）均顯示上調[20]。本研究選擇幾個有代表性的，與EMT改變密切相關的指標（如MMP-9、1型膠原）進行檢測，從研究結果可以看出，煙草煙霧暴露于人氣道上皮細胞（16HBE）后，能刺激其發生類似EMT的改變，這與文獻[4]的報道一致。刺激后的16HBE雖然沒有真正成為成纖維細胞，但從其形態變化、EMT標志物表達變化上分析，整體傾向于向成纖維細胞發展。然而，人體是一個復雜的有機體，而EMT又是一非常復雜的過程，上皮細胞短期暴露不可能完全轉變為成纖維細胞，所以在本研究中只能看到其向成纖維細胞改變的趨勢。由此，進一步開展其體內試驗的研究非常有必要。本實驗表明，CSC刺激16HBE細胞7 d后，無論是細胞形態還是基因表達都向EMT樣的改變發展，標記物表達與細胞形態學改變均符合EMT樣的轉變，這可能為香煙煙霧暴露致COPD氣道重塑的發病機制提供線索。但由于香煙及其煙霧中含有3800多種化合物，其有害物質組分復雜，關于煙草煙霧何種成分在其中發揮主要作用，研究甚少。尼古丁是煙草中的主要致成癮成分，且在香煙煙霧中的含量較高，最近有研究推測[21]，尼古丁可能通過誘導上皮細胞轉分化參與吸煙所致COPD患者氣道重構，因此關于其有害成分的體外試驗研究仍有待進一步開展。endprint

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（收稿日期：2017-03-27） （本文編輯：程旭然）endprint