小鼠胚胎心動脈囊的發生發育

張潔+張濤+李海榮+楊艷萍+崔慧林+曹錫梅

【摘要】 目的：探討小鼠胚胎動脈囊的發生發育及其與第二生心區的關系。方法：對胚齡9～13 d（ED9～13）小鼠頭胸部切片做HE和免疫組織化學PAP法染色。結果：ED10，動脈囊出現于心流出道遠端，管壁主要由胰島素增強子結合蛋白-1（ISL1）陽性內皮和間充質細胞構成，可見第二生心區、原始咽腹側壁內胚層的ISL1陽性細胞增生并遷移至動脈囊壁。ED11～12，心動脈端向尾端移位、心包腔向頭端及背側擴展及ISL1陽性細胞的添加使動脈囊大部降入心包腔。ED12～13，含有ISL1陽性細胞的主肺動脈隔與流出道嵴愈合，將心包內動脈囊分隔為升主動脈和肺動脈干；動脈囊壁ISL1陽性細胞分化為大動脈相鄰及游離壁的平滑肌細胞。結論：小鼠胚胎動脈囊是第二生心區細胞添加在流出道遠端形成的。動脈囊壁ISL1陽性細胞分化為流出道心肌和主肺動脈干的平滑肌。

【關鍵詞】 胚胎； 動脈囊； 胰島素增強子結合蛋白-1； 免疫組織化學； 小鼠

【Abstract】 Objective：To research the development of aortic sac in mouse embryo and its association with the second heart field.Method：Serial paraffin sections through head to thorax of mouse embryo，from embryonic day 9 to 13（ED9-13），were stained with HE or immunohistochemical PAP method.Result：ED10，the aortic sac appeared distal to the outflow tract.Its wall was mainly composed of islet-1（ISL1） positive endothelium and mesenchymal cells.At this period，ISL1 positive cells from the second heart field and ventral endoderm of the primitive pharynx were observed migrating into the aortic sac.During ED11-12，the arterial pole of the heart moving caudally，the pericardial cavity expanding rostral and dorsally and the addition of ISL1 positive cells to the aortic sac collaboratively caused most of the aortic sac descended into the pericardial cavity.During ED12-13，the aorticopulmonary septum containing ISL1 positive cells，from the dorsal wall of the aortic sac，fused with the distal ridges of the outflow tract， resulting in the aortic sac in the pericardial cavity being separated into the ascending aorta and the pulmonary trunk.During this period，ISL1 positive cells in the aortic sac wall gradually differentiated into the smooth muscle cells of the facing walls and lateral walls of the great arteries.Conclusion：In the mouse embryo，the aortic sac develops from the addition of the second heart field-derived cells to the outflow tract.ISL1 positive cells in its wall differentiate into myocardium of the outflow tract and smooth muscle of the aortic and pulmonary trunk.

【Key words】 Embryo； Aortic sac； Islet-1； Immunohistochemistry； Mouse

First-authors address：Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.009

胚胎心動脈極發生發育異常導致先天性心血管缺陷[1]。22q11.2缺失綜合征患者80%有先天性主動脈弓畸形[2]，傳統觀點認為主動脈弓源自胚胎早期的動脈囊。動脈囊連接弓動脈和流出道，主要由間充質構成。胚胎心流出道是右心室遠端延伸至心動脈端的心肌性管道，內襯內皮，與心肌間為心膠質。因成體無動脈囊，多數學者將成體心室的流出道對應于胚胎心流出道，多關注胚胎流出道的發生發育。亦有學者將動脈囊和流出道作為整體進行研究，但忽視對動脈囊的觀察[3-4]。近來發現流出道是原始心管形成后第二生心區添加在心動脈端形成的[5-7]，隨流出道近段逐漸心室化[8-9]，流出道遠端心肌界逐漸向心包腔內退卻，提示動脈囊的發生發育可能亦與咽部組織的添加有關。endprint

本研究用抗α-平滑肌肌動蛋白（SMA）抗體標記早期分化的心肌細胞和平滑肌細胞[10-11]，用抗ISL1抗體標記第二生心區細胞[12-13]，用抗心肌肌球蛋白重鏈（MHC）抗體標記心肌，對ED9～13小鼠頭胸部的切片進行HE和免疫組織化學染色，觀察了動脈囊的發生發育及轉歸。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本制作 購買山西醫科大學實驗動物中心足3月齡健康雌性中國昆明小鼠32只，體重23～32 g，在明暗相間條件下自由進食飲水飼喂（明：7 am～7 pm），動情期與同種3月齡健康雄性小鼠于7∶30 pm合籠，次晨分籠，發現陰栓者即為妊娠0.5 d。乙醚麻醉妊娠小鼠，剖腹收集ED9～13胚胎，ED9胚胎帶子宮固定，其余胚齡胚胎從子宮內剝離出后固定。標本經甲醇：丙酮：水（2∶2∶1 v/v）混合固定液室溫下固定24 h后梯度乙醇、正丁醇脫水透明，石蠟包埋。取不同胚齡胚胎5～7只，制作為8 μm厚連續石蠟切片，每4片取1片做HE染色以觀察各胚胎的形態結構，選出頭胸部的切片用于免疫組織化學PAP法染色。載玻片經多聚賴氨酸處理。

1.2 免疫組織化學PAP法染色 所選標本經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，3%H2O2、TENG-T

[10 mmol/L Tris，5 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），150 mmol/L NaCl，0.25% gelatin，0.05% Tween-20，pH=8.0]依次各處理30 min，以減低內源性過氧化物酶活性和非特異性背景染色。處理后的切片分別用小鼠抗心肌肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，1∶1000，upstate）單克隆抗體、小鼠抗胰島素增強子結合蛋白-1（islet-1，ISL1，1∶100，Developmental Studies Hybridoma Bank）單克隆抗體、小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，SMA，1∶800，IA4，Sigma）單克隆抗體室溫下過夜孵育。孵育后的切片順次滴加兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG、兔過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物各孵育2、2、1.5 h；DAB顯色，蒸餾水終止，陽性結果呈棕黃色。常規脫水、透明、封片。抗體均用pH值7.4 1×PBS稀釋。

2 結果

ED9，心管靜脈端尚未融合，流出道的形成使心管向右成襻（圖1A～1D）。心管心肌表達MHC（圖1B）、SMA（圖1C），但大部分不表達ISL1（圖1D）。流出道外包心肌，內襯內皮，兩者之間為豐富心膠質，心膠質內無細胞（圖1B～1C）。其動脈端未見動脈囊，直接通入1st弓動脈（圖1A）。原始咽外側ISL1陽性細胞（圖1D↑）經背側心包添加至流出道壁并逐漸表達SMA（圖1C↑）、MHC（圖1B↑）。

ED10，鰓弓內間充質細胞增多，流出道遠端出現由內皮和間充質細胞構成的動脈囊，管壁無心膠質（圖2A～2D）。連續切片示動脈囊除尾端腹面外，大部分包埋于心包腔外咽部間充質內，通過弓動脈連于背主動脈（圖2D）。動脈囊壁細胞多呈ISL1陽性，除鰓弓、體壁及心動脈端心包的ISL1陽性細胞（圖2C）外，還可見原始咽腹側壁內胚層的ISL1陽性細胞（圖2C↑）增生并遷移至心包背側壁及動脈囊壁，這些細胞于近流出道心肌處逐漸表達SMA（圖2B↑）和MHC（圖2A↑）。

ED11～12，鰓弓內、動脈囊壁間充質細胞增加（圖3A～3D）。動脈囊背側的喉氣管溝（或憩室）上皮及其腹側大部分間充質細胞呈ISL1陽性（圖3C）。心動脈端向胚體尾端移位、心包腔向頭端及背側的擴展以及喉氣管原基腹側、心動脈端心包及體壁ISL1陽性細胞向動脈囊的添加使4th弓動脈尾側的動脈囊移入心包腔內（圖3A～3D）。ED12，4th、6th弓動脈間喉氣管腹側的ISL1陽性間充質向動脈囊內突起形成主肺動脈隔，表面覆有SMA陽性細胞，其腹面與流出道嵴遠端愈合將動脈囊分隔為心包內升主動脈和肺動脈干的雛形（圖3A～3D）。添加至升主動脈和肺動脈干的ISL1陽性細胞（圖3C）僅逐漸表達SMA（圖3B），不表達MHC（圖3A）。

ED13，心包內升主動脈和肺動脈干明顯增長，管壁增厚，SMA陽性細胞增多（圖4A），未見MHC表達。心包背側壁及氣管腹側的ISL1陽性細胞明顯減少，仍可見向升主動脈及肺動脈干的添加（圖4B↑）。

3 討論

動脈囊是心動脈端一個獨立的結構，有獨特的組織學結構，主要由間充質細胞構成。本研究發現，ED9，心管尚在融合中，動脈端向右彎曲成襻。流出道遠端直接通入1st弓動脈，兩者之間無形態和組織學結構與流出道不同的動脈囊。流出道管壁由心肌、心內膜及不含細胞的心膠質構成。此時，原始咽背外側ISL1陽性細胞向流出道遠端遷移并逐漸表達心肌標志SMA和MHC，表明第二生心區細胞不斷分化為心肌細胞至心動脈端使流出道增長。Hiruma等[14]報道妊娠8.5 d（GD8.5）晚期心管動脈端通過腹主動脈、動脈襻（兩者相當于1st弓動脈）連于背主動脈，但未對動脈囊進行探討。ED10，流出道遠端與弓動脈間出現由內皮和間充質細胞構成的動脈囊，管壁無心膠質，除尾端腹面外，大部分包埋于心包外間充質中；可見鰓弓、體壁、動脈端心包及動脈囊背側咽內胚層的ISL1陽性細胞增生并遷移動脈囊壁，提示繼流出道形成后，第二生心區ISL1陽性細胞向心動脈端添加形成了動脈囊。同時這些細胞于動脈囊與流出道交界處逐漸表達SMA和MHC，表明動脈囊近端的細胞受心肌細胞的誘導不斷分化為心肌細胞使流出道增長，動脈囊是第二生心區心肌前體細胞進入心流出道的通道。ED11～12，隨著尾端鰓弓及弓動脈的形成，鰓弓、動脈端心包、體壁及氣管腹面ISL1陽性第二生心區細胞在動脈囊壁不斷添加，動脈囊向尾端延伸，心動脈端向胚體尾端移位、心包腔向頭端及背側的擴展使動脈囊逐漸向心包腔內移位。目前資料多報道胚胎心流出道源于第二生心區，并未指出動脈囊與其相同的胚胎學來源。endprint

Waldo等[15]報道雞胚流出道遠端尾側心包反折處的第二生心區，表達遷移標志HNK1，于Stage16～19（S16～19）添加至流出道分化為心肌，于S22～24添加至動脈囊區分化為升主動脈和肺動脈干根部游離壁的平滑肌，其余大血管壁的平滑肌細胞來自神經嵴。第二生心區心肌前體細胞呈螺旋狀添加至流出道的對側壁，平滑肌前體細胞則垂直進入動脈囊壁。第二生心區來源的平滑肌細胞SMA的表達晚于神經嵴來源的平滑肌細胞。認為大血管根部第二生心區來源的心肌和平滑肌之間及第二生心區來源和神經嵴來源的平滑肌之間的“縫”是馬凡綜合征主動脈夾層的好發部位[11]。心神經嵴切除后，心肌前體細胞到達流出道遠端心肌而未進入流出道，平滑肌前體細胞則正常添加至心動脈端[15]；神經嵴切除致添加至流出道遠端心肌的第二生心區細胞減少，流出道變短，心襻形成異常，但均未觀察對動脈囊形態及結構的影響[16]。本結果表明，ED9～11，第二生心區細胞添加至心動脈端分化為流出道心肌，ED12～13，第二生心區細胞添加至心動脈端形成大血管壁的平滑肌細胞。Jiang等[17]用Wntl-Cre轉基因鼠發現主動脈和肺動脈干近段由神經嵴細胞和平滑肌細胞構成，并推斷后者可能來自氣管附近咽部組織。我們的結果表明，ED10～13，流出道可能誘導其背側的咽腹側上皮增生增厚，形成喉氣管溝（喉氣管憩室）上皮及其腹側的ISL1陽性細胞群，這些細胞可能受遠端流出道的吸引，逐漸添加在其遠端參與形成動脈囊壁。在基因調控和局部微環境作用下，于ED10～11，動脈囊近流出道的ISL1陽性細胞分化為心肌，于ED12～13，動脈囊壁大部分ISL1陽性細胞分化為大血管壁的平滑肌。有文獻報道ISL1陽性第二生心區細胞不僅形成大血管的游離壁，亦參與形成其相鄰壁[12]。本研究結果表明，隨著動脈囊被分隔為升主動脈和肺動脈干，主肺動脈隔內的ISL1陽性細胞形成大血管相鄰壁的平滑肌細胞，其余動脈囊壁的ISL1陽性細胞形成游離壁的平滑肌細胞。本結果支持ISL1陽性第二生心區細胞是多潛能細胞，不僅可以分化為心肌、心內膜細胞，還可以分化為大血管壁的平滑肌細胞[11，13，18-20]，文獻[21]報道部分心神經嵴細胞亦表達ISL1。

參考文獻

[1] Hoffman J I，Kaplan S.The incidence of congenital heart disease[J].J Am Coll Cardiol，2002，39（12）：1890-1900.

[2] Momma K.Cardiovascular anomalies associated with chromosome 22q11.2 deletion syndrome[J].Am J Cardiol，2010，105（11）：1617-1624.

[3] Anderson R H，Mori S，Spicer D E，et al.Development and Morphology of the Ventricular Outflow Tracts[J].World J Pediatr Congenit Heart Surg，2016，7（5）：561-577.

[4] Ya J，van den Hoff M J，de Boer P A，et al.Normal development of the outflow tract in the rat[J].Circulation Research，1998，82（4）：464-472.

[5] Mjaatvedt C H，Nakaoka T，Moreno-Rodriguez R，et al.The outflow tract of the heart is recruit ED from a novel heart-forming field[J].Dev Biol，2001，238（1）：97-109.

[6] Kelly R G，Brown N A，Buckingham M E.The arterial pole of the mouse heart forms from Fgf10-expressing cells in pharyngeal mesoderm[J].Dev Cell，2001，1（3）：435-440.

[7] Buckingham M，Meilhac S，Zaffran S.Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells[J].Nat Rev Genet，2005，6（11）：826-835.

[8] Rana M S，Horsten N C，Tesink-Taekema S，et al.Trabeculated right ventricular free wall in the chicken heart forms by ventricularization of the myocardium initially forming the outflow tract[J].Circ Res，2007，100（7）：1000-1007.

[9]李海榮，楊艷萍，王晶晶，等.小鼠胚胎心流出道近段心室化形成右心室小梁部[J].解剖學報，2014，45（5）：698-703.

[10]李海榮，李素云，楊艷萍，等.人胚胎早期心臟流出道的發育[J].解剖學報，2008，39（3）：400-405.

[11] Waldo K L，Hutson M R，Ward C C，et al.Secondary heart field con-tributes myocardium and smooth muscle to the arterial pole of the developing heart[J].Dev Biol，2005，281（1）：78-90.endprint

[12] Sizarov A，Lamers W H，Mohun T J，et al.Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart[J].J Anat，2012，220（4）：336-349.

[13] Cai C L，Liang X，Shi Y，et al.Isl1 identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart[J].Dev Cell，2003，5（6）：877-889.

[14] Hiruma T，Nakajima Y，Nakamura H.Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo[J].Journal of Anatomy，2002，201（1）：15-29.

[15] Waldo K L，Hutson M R，Stadt H A，et al.Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field[J].Dev Biol，2005，281（1）：66-77.

[16] Yelbuz T M，Waldo K L，Kumiski D H，et al.Shortened outflow tract leads to altered cardiac looping after neural crest ablation[J].Circulation，2002，106（4）：504-510.

[17] Jiang X，Rowitch D H，Soriano P，et al.Fate of the mammalian cardiac neural crest[J].Development，2000，127（8）：1607-1616.

[18] Moretti A，Caron L，Nakano A，et al.Multipotent embryonic isl1+ progenitor cells lead to cardiac， smooth muscle， and endothelial cell diversification[J].Cell，2006，127（6）：1151-1165.

[19] Bu L，Jiang X，Martin-Puig S，et al.Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages[J].Nature，2009，460（7251）：113-117.

[20] Laugwitz K L，Moretti A，Caron L，et al.Islet1 cardiovascular progeni-tors：a single source for heart lineages[J].Development，2008，135（2）：193-205.

[21] Engleka K A，Manderfield L J，Brust R D，et al.Islet1 derivatives in the heart are of both neural crest and second heart field origin[J].Circulation Research，2012，110（7）：922-926.

（收稿日期：2017-01-16） （本文編輯：程旭然）endprint