血清中IncRNA-PVT1的檢測方法建立及在肝癌診斷中的應用

朱怡卿

【摘要】目的：建立在血清中檢測長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，IncRNA）PVt1的方法，并探討該檢測在肝癌診斷中的應用價值。方法：收集肝癌患者血清樣本50例，正常志愿者血清樣本40例，10對肝癌及癌旁組織樣本。分別通過TRIzol和TRIzo LS提取組織和血清中的RNA，通過real-time PCR檢測組織和血清中IncRNA-PVTl的相對含量。結果：IncRNA-PVTl在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織（P<0.01），IncRNA-PVT1在肝癌患者的血清中的表達顯著高于正常患者。結論：成功建立了在血清中檢測IncRNA-PVTl的方法，血清中IncRNA-PVTl的表達可以作為肝癌診斷的生物標志。

【關鍵詞】血清;檢測;肝癌

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一。據報道，全球每年有超過60萬肝癌患者去世[1]。盡管外科治療技術及放、化療技術的進步極大地改善了肝癌患者的預后，但是當前針對肝癌的有效的治療手段依然十分有限，肝癌患者，特別是晚期肝癌患者的術后生存率依然不樂觀[2]。早期診斷和靶向治療是腫瘤治療的新方向，因此，發掘與肝癌發生密切相關的分子標志對肝癌的治療具有重要的意義。

長鏈非編碼RNA （long non-codingRNA，IncRNA）是指長度超過200bp的一類非編碼RNA分子[3]。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的研究表明，IncRNA在物種間的表達具有較高的保守性和時空特異性，可通過吸附內源性的miRNA，結合蛋白質等方式廣泛的參與生命活動調控[4]。同時，大量研究表明IncRNA表達的紊亂與多種疾病的發生發展密切相關。目前，已有研究表明IncRNA-PVTI在肝癌組織中特異性高表達，并可通過調控NOP2蛋白的穩定性、特異性吸附miRNA參與肝癌的發生發展，是肝癌早期診斷和靶向治療的潛在生物標志。然而，血清中檢測IncRNA-PVTl的檢測方法，及其在肝癌診斷中的意義仍無報道。因此，本研究擬從肝癌中特異性高表達的原癌基因IncRNA-PVT1入手，建立在血清中檢測IncRNA-PVT1的方法，評價血清中IncRNA-PVTl表達檢測對肝癌診斷的意義。

1 樣本與實驗方法

1.1 臨床樣本

臨床樣本取自2016年至2017年期間在第二軍醫大學第三附屬醫院東方肝膽醫院就診的肝癌患者及正常志愿者，在納入排除標準下共收集到10對肝癌及癌旁組織，50例肝癌患者血清及40例正常健康志愿者血清。

1.2 RNA提取

采用TRIzol LS試劑（美國Invitrogen公司）提取血清中的RNA。按照說明書提取，最終凍存于-80℃。采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取組織中的RNA。根據試劑說明書進行提取，最終用35μL無酶水溶解RNA，凍存于-80℃。

1.3 real-time PCR檢測

采 用PrimeScriptTM RT Reagent Kitwith gDNA Eraser試劑（大連TaKaRa公司）對總RNA進行逆轉錄。采用SYBRPremix Ex Taq II試劑（大連TaKaRa公司）對合成的cDNA進行擴增，反應體系為10 μL。IncRNA-PVTl的5對不同區段的引物如下：Pl上游引物5'-CGCTTCGCAGTGGAATGGAA-3'，Pl 下 游 引 物5-CC-GTGGCA-TTTCTGGTCTTGT-3：P2上游 引 物5'AAGACGGGCA-CTCACAGACA-3，P2下游引物5'AGC-GTTCTCTGGGCGTTCAT-3：P3上游弓I物5'ACAGAGTCCGTTCAGTGTCAGA-3'，P3 下 游 引 物5'ATT-GGGCTGG-GTCTACACAAGT-3'; P4 上游 引 物5'TGC-TTCGTGCTGATTCCTAGAC-3'，P4下 游 引 物5'TTGC-TCTGTGCTGCCAGTTAG-3'; P5上游引物5'GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'，P5下 游 引 物5'ACAC-AAAGTGCATACCTACCCA-3'。GAPDH 的引 物 如下：上游5'-TGAAGGTCGGAGTCAACG GATT-3，下 游5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。

1.4 統計學方法

采用Mann-Whitney分析比較IncRNA-PVT1在肝癌患者血清、志愿者血清中的表達差異，采用配對t檢驗比較IncRNA-PVT1在肝癌、癌旁組織中表達的差異。使用GraphPad Prism 6.0（ Graphpad SoflwareInc，Caligomia）軟件進行所有統計學分析。

2 結果

2.1 IncRNA-PVTl片段在血清中表達的檢測

考慮到IncRNA-PVTl長度為1957bp，在外周血中多以片段的形式存在，所以我們針對IncRN-PVTl的不同區域設計了5對檢測引物進行檢測。分別采用這5對引物，通過實時定量PCR的方法檢測5例肝癌患者和5例正常志愿者血清中IncRNA-PVTl的表達。實驗結果發現引物l，4，5均能在血清中檢測到IncRNA-PVT1表達， 而引物2，3未能檢測到IncRNA-PVTl的表達（圖1）。進一步的統計學分析顯示，引物5檢測到的正常志愿者和肝癌患者血清中的IncRNA-PVTI具有顯著的統計學差異（P<0.01），所以，我們選擇引物5進行后續研究。

2.2 IncRNA-PVTl片段在肝癌患者血清中高表達

為了明確引物5在組織及血清中檢測IncRNA-PVTl表達的有效性，我們收集了10對肝癌及癌旁組織樣本，以及50例肝癌患者血清和40例正常志愿者血清樣本。結果顯示，10例組織樣本中，8例肝癌組織中IncRNA-PVTl呈顯著高表達（P<0.05，圖2A），且肝癌患者血清中IncRNA-PVTl的表達顯著高于正常志愿者（P>0.01，圖2B）。提示血清中IncRNA-PVT1的表達值可能用于檢測結腸癌。

3 討論

近年來，大量研究顯示IncRNA在腫瘤的發生發展中具有重要的作用，是潛在的腫瘤早期診斷標志物及腫瘤靶向治療靶點。其中，IncRNA-PVTI是一種廣泛報道的癌胚分子，其表達異常與多種腫瘤的發生發展密切相關。但少有文獻報道IncRNA-PVTl在腫瘤患者血清中的表達。有研究提示，外周血中難以檢測到IncRNA主要是由于IncRNA的長度較長，在血液中不穩定且易斷裂，而主要以片段的形式存在于外周血中。Wang等的研究采用多對引物對IncRNA進行擴增后，發現IncRNA的部分片段確實呈高表達且穩定地存在于外周血中。因此，本研究設計了5對針對IncRNA-PVTl不同區段的引物，結果發現引物5的擴增效果最為明顯，而引物2和引物3都未能檢測出IncRNA-PVTl在血清中的表達，該研究結果表明，在血清中IncRNA-PVTl缺失可能以片段形式存在。采用引物5檢測IncRNA-PVTl在組織中的表達，發現大部分組織中IncRNA-PVT1呈高表達。進一步采用較大樣本檢測發現IncRNA-PVTl在結腸癌患者血清中的表達顯著高于正常志愿者，提示血清中IncRNA-PVTl的高表達可能是診斷肝癌的潛在生物標志。

綜上所述，本研究建立了穩定的在血清中檢測IncRNA-PVTl表達的方法，檢測結果表明肝癌患者血清中IncRNA-PVTl的表達顯著高于正常志愿者，提示血清中IncRNA-PVTl的表達值可能作為生物標志

診斷肝癌。

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[4] Wu Z， Liu X， Liu L， etal. Regulation of IncRNAexpression [J]. Cellular& molecular biologyletters，2014，19（04）：561.