PRR11在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制分析

趙婷婷

【摘要】乳腺癌被認(rèn)為是世界上比較嚴(yán)重的惡性腫瘤，對(duì)女性健康造成了嚴(yán)重的威脅。借助多種特征性腫瘤轉(zhuǎn)移模型、乳腺癌細(xì)胞模型乳腺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移階段PRR11的作用，能夠更好的反映出乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，本文將會(huì)對(duì)PRR11在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義、PRR11對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡所產(chǎn)生的影響、PRR11對(duì)乳腺癌遷移和侵襲所產(chǎn)生的影響、PRR11對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制等進(jìn)行探究，以期為乳腺癌的診斷和治療提高參考和借鑒。

【關(guān)鍵詞】PRR11;乳腺癌;細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移;調(diào)控機(jī)制

乳腺癌是臨床上的常見(jiàn)病和多發(fā)病，對(duì)于早期患者通過(guò)手術(shù)的方法給予切除，但是對(duì)于晚期患者則需要給予內(nèi)分泌治療或化學(xué)藥物治療。通過(guò)對(duì)乳腺癌的分子病理分型進(jìn)行分析和研究，不僅可以為其診斷和治療提供參考和借鑒，而且還可以提高患者的預(yù)后效果。近些年來(lái)，富含脯氨酸的蛋白（PRRII）是新發(fā)現(xiàn)的一類基因，其分布在染色體17q22上，主要包括了9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子，并且mRNA具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，能夠編碼360個(gè)氨基酸（約40kD），開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度達(dá)到了1083bp。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PRR11在胃癌、膽管癌、肺癌、胰腺癌等疾病中具有非常高的表達(dá)，而且參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖等行為，被公認(rèn)為促癌基因，因此對(duì)PRR11在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行分析尤為重要。

1 PRR11在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義

借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫熒光和免疫印跡來(lái)對(duì)乳腺癌細(xì)胞SK-BR3、MCF-7、MDA-MB-231以及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中PRR11的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)選擇免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)法來(lái)對(duì)正常組織與乳腺癌組織中PRR11的表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步明確乳腺癌組織中PRR11的表達(dá)與增殖指數(shù)、分子分型、腫瘤分期、組織分級(jí)等臨床病理特征之間的聯(lián)系。此外，還可以通過(guò)Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型和生存分析來(lái)對(duì)PRRII對(duì)乳腺癌細(xì)胞患者預(yù)后的影響進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

通常情況下，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示PRR11主要在乳腺癌細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，而且免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞系中PRR11的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)要超過(guò)正常乳腺組織和細(xì)胞。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，PRR11高表達(dá)的乳腺癌組織所存在的增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)要超過(guò)PRR11低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，并且隨著乳腺癌分期的提高PRR11的表達(dá)增加。實(shí)際上，PRRII的表達(dá)與腫瘤大小、病理分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、孕激素受體狀態(tài)等保持著非常密切的聯(lián)系，但是其與淋巴結(jié)狀態(tài)和年齡無(wú)明顯聯(lián)系。生存分析結(jié)果顯示與PRR11低表達(dá)患者相比，高表達(dá)患者生存期明顯縮短，該指標(biāo)可以作為乳腺癌患者預(yù)后效果的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

2 PRR11對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡所產(chǎn)生的影響

要想更好的了解和掌握PRR11表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡所產(chǎn)生的影響，則需要構(gòu)建空載體對(duì)照（RNAi-Vector）和慢病毒介導(dǎo)的下調(diào)體系（RNAi-PRRll），然后借助免疫印跡就可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出下調(diào)效果，從而得到PRR11穩(wěn)定下調(diào)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，同時(shí)還開(kāi)展了EdU、MTT、TUNEL（凋亡檢測(cè)）和平板克隆實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRIl-shRNA能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞的PRR11蛋白表達(dá)水平進(jìn)行下調(diào)，而且MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRR11表達(dá)下調(diào)后，乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞活力出現(xiàn)了不同程度的降低，并且在MTT實(shí)驗(yàn)第72小時(shí)，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的活力基本上下降到了51.0%和40.1%。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRR11表達(dá)下調(diào)后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分別從最好是的21.0±1.5%和28.2±2.2%降至11.5±2.1%和15.5±1.1%，從而反映出細(xì)胞DNA合成速率不同程度上受到了抑制。通過(guò)進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRR11表達(dá)下調(diào)前MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成數(shù)是110±11.5和148. 7±14.5，而PRR11表達(dá)下調(diào)后MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成數(shù)下降到了40.0±5.6和70±11.6，進(jìn)而反映出PRR11表達(dá)下調(diào)能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞的克隆形成能力起到一定的抑制作用。在含1%血清培養(yǎng)液中，對(duì)乳腺癌細(xì)胞孵育24h后，借助TUNEL實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)PRR11下調(diào)后可能對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRR11表達(dá)下調(diào)前MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率分別是1.0±0.2%和1.4±0.2%，而PRR11表達(dá)下調(diào)后MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別是12.1±0.9%和13.3土0.8%，因此可以判定PRR11表達(dá)下調(diào)后能夠有效降低乳腺癌細(xì)胞的抗乏血清饑餓能力，進(jìn)一步加快了細(xì)胞的凋亡。

3 PRR11對(duì)乳腺癌遷移和侵襲所產(chǎn)生的影響

3.1 PRR11表達(dá)上調(diào)能夠加快乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

要想更好的了解和掌握PRRII上調(diào)對(duì)乳腺癌遷移和侵襲所產(chǎn)生的影響，可以選擇乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，其中細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRI1表達(dá)上調(diào)后可以使MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞相對(duì)遷移距離達(dá)到了0.68±0.09和0.87士0.04，而PRR11表達(dá)正常時(shí)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞相對(duì)遷移距離為0.46±0.04和0.58±0.06。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRRII表達(dá)上調(diào)之前每個(gè)視野內(nèi)平均MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞侵襲數(shù)為106±9和146±15，PRR11表達(dá)上調(diào)后每個(gè)視野內(nèi)平均MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞侵襲數(shù)升高至175±13和315±17，從而可以反映PRRII表達(dá)上調(diào)能夠加快乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

3.2 PRR11表達(dá)下調(diào)能夠阻礙乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲

同樣借助細(xì)胞劃痕和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)PRR11表達(dá)下調(diào)對(duì)乳腺癌遷移和侵襲所產(chǎn)生的影響，細(xì)胞劃痕結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了Contro-RNAi的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的相對(duì)遷移距離為0.45±0.05和0.58±0.04，而轉(zhuǎn)染了RNAi-PRRll后MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的相對(duì)遷移距離下降至0.2±0.02和0.32±0.04。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRR11表達(dá)上調(diào)之前每個(gè)視野內(nèi)平均MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞侵襲數(shù)為104±8和13 7±14，PRR11表達(dá)上調(diào)后每個(gè)視野內(nèi)平均MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞侵襲數(shù)下降至36±4和48±7，從而可以反映IPRRI1表達(dá)下調(diào)能夠進(jìn)一步阻礙乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

3.3 PRR11表達(dá)上調(diào)能夠加快乳腺癌MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

通常情況下，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力方面，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是比較常用的標(biāo)志，為了研究PRR11是否能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生EMT，需要開(kāi)展一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。如果上調(diào)PRR11表達(dá)后，將會(huì)導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，而且使細(xì)胞從上皮樣逐漸向間質(zhì)樣進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRR11過(guò)表達(dá)后，可以降低MCF-7細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，并且提高間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentm和Fibronectin表達(dá)，從而可以說(shuō)明PRR11表達(dá)上調(diào)能夠加快乳腺癌MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

4 PRR11對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制

4.1 對(duì)PRR11潛在調(diào)控的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行篩選

通常情況下，PI3-K/Akt通路、Ras通路、Notch通路及Wnt/β-catenin通路被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的主要通路，此時(shí)可以選擇乳腺癌MCF-7細(xì)胞，并通過(guò)對(duì)PRR11上調(diào)前后對(duì)PI3 -K/Akt通路、Ras通路、Notch通路及Wnt/β-catenin通路所產(chǎn)生的影響進(jìn)行分析，通過(guò)開(kāi)展PI3-K激酶活性實(shí)驗(yàn)，可以得知PRR11表達(dá)增加與PI3 -K激酶活性之間不存在必然的聯(lián)系，并且Ras活性實(shí)驗(yàn)同樣顯示PRR11對(duì)Ras通路不會(huì)產(chǎn)生調(diào)控作用，但是Realtime PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果PRR11表達(dá)上調(diào)后，將會(huì)導(dǎo)致乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p-catenin表達(dá)升高，但是Notchl、Notch2、DLIA等分子并未出現(xiàn)比較明顯的變化，此時(shí)就可以分析PRRI1是否可以通過(guò)對(duì)Wnt/p-catenin通路進(jìn)行調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。

4.2 PRR11通過(guò)B-catenin信號(hào)通路可以完成對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控

本次研究過(guò)程中選擇了乳腺癌MCF-7細(xì)胞，并分析了在PRRI1調(diào)控乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移階段，β-catenin信號(hào)通路所起到的作用，通過(guò)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，如果PRR11表達(dá)上調(diào)后，將會(huì)導(dǎo)致乳腺癌MCF-7細(xì)胞中核內(nèi)表達(dá)量和β-catenin信號(hào)總表達(dá)量出現(xiàn)升高現(xiàn)象，并且調(diào)控的下游基因c-myc、cyclinDl、Vimentin和E-cadherin表達(dá)同樣也會(huì)出現(xiàn)升高現(xiàn)象。反之，如果PRR11表達(dá)下調(diào)后，將會(huì)導(dǎo)致上述指標(biāo)也隨之下降。該研究結(jié)果可以反映PRRI1升高可能促進(jìn)p-catenin表達(dá)，并逐漸其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，這樣一來(lái)就可以推動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。為此可以借助雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果PRR11上調(diào)后，將會(huì)激活p-catenin轉(zhuǎn)錄，并提高質(zhì)粒熒光強(qiáng)度（TOPIFOP），反之如果PRR11表達(dá)下調(diào)，將會(huì)減弱熒光強(qiáng)度，從而反映出PRR11的確可以促進(jìn)β-catenin轉(zhuǎn)錄因子的活性。

4.3 阻斷β-caterun信號(hào)通路能夠抑制PRR11對(duì)細(xì)胞增殖和遷移

為了更好的了解和掌握PRR11可以借助β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，可以對(duì)乳腺癌MCF-7中PRR11表達(dá)給予上調(diào)，并通過(guò)siRNA下調(diào)了β-catenin的表達(dá)，隨后就可以開(kāi)展細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)和相關(guān)分子檢測(cè)。通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，β-catenin表達(dá)下調(diào)后，如果對(duì)PRR11表達(dá)進(jìn)行上調(diào)將會(huì)導(dǎo)致c-myc、cyclinDl、Vimentm表達(dá)增加被抵消，但是E-cadherin表達(dá)將會(huì)逐漸恢復(fù)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，β-catenin表達(dá)下調(diào)，同時(shí)PRR11上調(diào)將會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒熒光強(qiáng)度升高被抵消。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都可以說(shuō)明PRR11可以有效的作用于p-catenin信號(hào)通路，并通過(guò)β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的有效調(diào)控。

5 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，乳腺癌對(duì)人類的身體健康和生命安全造成了較大的威脅，而誘病因素比較多，而且確保患者的病情得到有效的診斷和治療，則需要分析和探究PRR11在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，以便對(duì)乳腺癌病情有個(gè)全方位的了解和掌握，進(jìn)而提高其治療效果。

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