“三焦針法”對癡呆小鼠線粒體膜通道孔活性的調控及神經細胞凋亡的影響*

王 亮,邢 菁,郭睿婧,韓秀娣,付 于

(1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.天津市環湖醫院，天津 300193;4.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病。其主要的病理改變為選擇性神經元丟失、彌漫性腦萎縮、大量老年斑、神經纖維纏結等[1]。而細胞凋亡在AD神經元丟失中有著重要影響，尤其是在大腦皮質和海馬區的神經元丟失更為突出[2]。大量研究表明，線粒體功能障礙導致的細胞凋亡在AD的發病機制中有著重要作用[3]。線粒體膜通透性轉換孔(mitochondria permeability transition pore，mPTP)是存在于線粒體內外膜之間的一組蛋白復合體，是一種非特異性通道。MPTP一旦形成,會導致線粒體膜電位下降、細胞色素c(Cytochrome C，Cytc)釋放和軸突線粒體轉運受損，最終引起線粒體功能結構崩解、AD神經元細胞死亡[4]。B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白廣泛分布在線粒體外膜，可調節mPTP的開放和閉合，被認為是經線粒體途徑調節細胞凋亡的重要蛋白[5]。

韓景獻教授首創的“三焦針法”能夠提高AD患者的認知功能和生活能力，是阿爾茨海默病的有效治療手段[6]。本課題組前期研究發現，“三焦針法”能明顯抑制線粒體內鈣離子的蓄積，減少氧自由基的產生，說明“三焦針法”能夠改善線粒體功能[7]。深入研究發現，快速老化小鼠皮質、海馬線粒體中mPTP相關蛋白β-淀粉樣蛋白42(β-amyloid42，Aβ42)、CypD含量升高，且“三焦針法”可下調Aβ42、CypD蛋白含量[8]，從而推測出AD發生與mPTP過度開放有關，且“三焦針法”能夠調節mPTP的活性，減緩線粒體功能障礙的發生。本研究從線粒體膜通道孔開放的角度，探討 “三焦針法”通過對Bcl-2蛋白的調控從而抑制AD細胞凋亡的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇和分組

選用健康雄性8月齡SAMP8快速老化癡呆小鼠和SAMR1同品系正常小鼠。SAMP8型小鼠，是目前國內外公認的比較標準化的AD動物實驗模型，由天津中醫藥大學第一附屬醫院老年腦病研究室動物中心提供,清潔級,合格證號:W-J津實動質M準字第006號。

小鼠隨機分為SAMP8空白對照組、SAMP8非穴位針刺組、SAMP8穴位針刺組和SAMR1正常對照組(以下簡稱為SAMP8組、非穴組、針刺組、SAMR1組)，每組各6只(此動物數僅為1個實驗指標的基本動物數)。

1.2 針刺方法

針刺組：采用“三焦針法”進行針刺，取穴為膻中、中脘、氣海、雙側外關、雙側血海和雙側足三里，穴位定位參照十五規劃教材《實驗針灸學》。針刺方法：其中血海穴施捻轉瀉法30 s，其余各穴分別施捻轉補法30 s。每日針刺1次，持續30天，每7天休息1次。

非穴組：取雙脅下兩個固定非穴位點，平補平瀉手法105 s。方案同針刺組。

SAMP8組和SAMR1組:兩組均不予針刺操作，只進行相同時間和程度的捉抓。

1.3 實驗試劑和儀器

試劑：線粒體提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、Janus Green B(Sigma 公司)、純化線粒體膜通道孔熒光檢測試劑盒(GENMED，美國)、原位細胞凋亡檢測試劑盒(美國ROCHE公司出品)、DAB檢測試劑盒(購于河北博海生物工程有限公司)，BCA試劑盒(上海生工)、Bcl-2抗體(CST，美國)、辣根酶標記山羊抗兔IgG( SP-9001，北京中杉金橋生物公司)、Western Blotting 化學發光試劑(Millipore)。

儀器：熒光分光光度計(Cary Eclipse，澳大利亞)、垂直電泳槽(DYCZ-24D, 北京六一儀器廠)、多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(美國Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus)、針灸針(0.3 mm×40 mm，蘇州)。

1.4 熒光分光光度計檢測各組小鼠RFU值

小鼠皮質、海馬線粒體提取：使用線粒體提取試劑盒從各組小鼠皮質、海馬提取線粒體，并用0.1% Janus Green B染色鑒定，在光鏡下，觀察到藍綠色圓形顆粒。將純化好的線粒體樣品用GENMED染色液染色，并用熒光分光光度計檢測，讀取相對熒光數值(Relative Fluorescence Units，RFU)。用RFU值代表線粒體膜通道孔的開放狀態，RUF值降低表明膜通道孔活性增強，反之亦然。

1.5 Western Blot定量分析線粒體Bcl-2的含量

將線粒體分離，用BCA試劑盒檢測線粒體蛋白含量；再采用Western Blot 方法定量分析，將SDS丙烯酰胺凝膠電泳，而后轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶液封閉膜2 h后，與Bcl-2抗體孵育、再與辣根酶標記山羊抗兔IgG孵育、漂白后，用化學發光試劑顯色、拍照，凝膠圖像分析系統分析條帶的灰度值。每組樣品測3次，取均值；以β-actin為參照物。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡

將腦組織放入4%的多聚甲醛固定液中固定、保存。石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水；用蛋白酶K(20 μg/mL溶于Tris/HCl中，Ph7.4～8.0)孵育。滴加50 uL的TUNEL反應混合溶液、孵育，然后在熒光鏡下分析結果。加入50 uL轉化劑-POD進行信號轉化和分析。最后加入50～100 μL DAB底物溶液，木素復染細胞核，在光鏡下圖象分析。

1.7 讀取各組細胞凋亡IHS評分

TUNEL法染色得到的陽性神經元，體積縮小，形態不規則，核呈棕黃色，其他細胞核為藍色(見圖3)，這一結果與其他實驗研究[9]一致。每張切片選取5個高倍視野，每只小鼠共計數10個視野內陽性細胞總數染色結果用免疫組化評分(IHS)表示，IHS=A×B；A為陽性細胞百分比對應的值：陽性的細胞數<5%為0分，5～25%為1分，25～50%為2分，50～75%為3分，>75%為4分；B為陽性細胞染色強度，0～1分為不著色(-)，2～4分為淺黃色(+),5～8分為棕黃色(++),9～12分為棕褐色(+++)。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠RFU值

見表1、圖1。結果顯示相對于SAMR1組， SAMP8組與非穴組的RUF值明顯降低，針刺組與SAMR1組沒有顯著差異。

表1 各組小鼠RFU值比較

圖1 各組小鼠海馬與皮質的RFU值比較

2.2 各組小鼠皮層、海馬線粒體Bcl-2的表達及針刺效應

由圖2、表2得出以下結果：皮質中：SAMP8組與SAMR1組比較，Bcl-2蛋白表達下調，有顯著差異(P<0.05)；針刺組與SAMP8組比較，Bcl-2蛋白表達上調(P<0.05)，并趨向SAMR1組；非穴組與SAMP8組比較，無顯著性差異(P>0.05)，與針刺組比較, Bcl-2蛋白表達下調(P<0.05)。

海馬中：SAMP8組與SAMR1組比較，Bcl-2蛋白表達下調，有顯著差異(P<0.05)；針刺組與SAMP8組比較，Bcl-2蛋白表達上調(P<0.05)，并趨向SAMR1組；非穴組與SAMP8組和針刺組比較, Bcl-2蛋白表達下調(P<0.05)。

圖2 各組小鼠皮層、海馬線粒體Bcl-2的Western-blot電泳圖 注：A：SAMR1組皮質;B：SAMP8組皮質;C：針刺組皮質;D：非穴組皮質;E：SAMR1組海馬;F：SAMP8組海馬;G：針刺組海馬;H：非穴組海馬

組別皮質海馬SAMR1組0．71±0．030．58±0．03SAMP8組0．49±0．09?#0．37±0．04?#非穴組0．42±0．10?0．31±0．08?針刺組0．63±0．09△0．51±0．05△

注：與SAMR1組比較，*P<0.05；與針刺組比較，#P<0.05；與非穴組比較，△P<0.05

2.3 各組細胞凋亡IHS評分

由封三彩圖3、表3得出以下結果；海馬：各組間IHS評分比較無明顯差異，P>0.05；SAMP8組與SAMR1組的IHS評分比較，無統計學差異(P>0.05)，但有明顯升高趨勢；與針刺組比較，無統計學差異(P>0.05)，但有下降趨勢。皮層：SAMP8組與SAMR1組的IHS評分比較，P<0.05；非穴組與SAMR1組比較，P<0.05；針刺組與非穴組比較，P<0.05；針刺組與SAMP8組比較，IHS評分無統計學差異(P>0.05)，但有明顯的下降趨勢；其余各組間比較無統計學差異，P>0.05。

表3 各組細胞凋亡IHS值比較

注：與SAMR1組比較，*P<0.05；與非穴組比較，▼P<0.05

3 討論

“三焦針法”主要是從調理三焦氣化能夠延緩衰老和防治老年病的角度所創立的，通過針刺膻中、中脘、氣海、血海和足三里諸穴來調節上、中、下三焦之氣。老年性癡呆是伴隨衰老出現的最常見疾病之一，祖國醫學認為該病屬于癲狂、癡呆范疇，病位在腦，與三焦氣化功能失常有關。《圣濟總錄·三焦門·三焦統論》所言“三焦有名無形，主持諸氣”，三焦是氣的升降出入的通道，又是氣化的場所，故具有總司全身氣機和氣化的功能。《難經》中記載：“三焦者，元氣之別使也，主通行三氣，經歷五臟六腑”，充分說明了人體的氣歷經三焦這個通道而輸布到五臟六腑，以維持人體正常生命活動。三焦氣化功能異常，氣血津液升降出入通道不暢，導致內生風、火、濕、熱諸邪及痰濁、血淤、濁毒等病理產物。由此韓景獻教授認為老年性癡呆癥是由于正常的衰老導致三焦氣化失常，因而氣血津液衰敗，痰瘀濁毒滋生，致陰陽失調。故而選穴膻中、中脘、氣海、血海、足三里以維持上焦如霧、中焦如漚、下焦如瀆的狀態[10-11]。而且近來實驗研究表明“三焦針法”通過改善腦內能量代謝、糾正衰老相關基因與蛋白的異常表達、修復神經元損傷、清除氧自由基來治療AD，及通過改善腦內總膽固醇水平和影響神經遞質來改善AD患者的認知功能[12-13]。因此，“三焦針法”是治療AD的一種有效方法。

mPTP開放會造成包括輔因子和離子在內的所有小型電解質平衡跨越線粒體膜，導致線粒體和細胞質之間的代謝梯度被破壞，而且釋放出累積的鈣致使線粒體滲透膨脹，線粒體膜電位的消散以及線粒體呼吸鏈的損傷，從而減少線粒體氧化磷酸化過程,進而導致三磷酸腺苷產生減少和活性氧生成增加，因此大量的mPTP形成可致線粒體損傷和細胞凋亡[4,14]。mPTP開放改變了線粒體結構和功能，這對與衰老有關的神經元損傷方面起著中樞作用。通過熒光分光光度計檢測線粒體膜通道孔的開放狀態發現，SAMP8組小鼠皮層和海馬的mPTP活性高于SAMR1組；而針刺后，其mPTP活性明顯降低，說明“三焦針法”能夠抑制mPTP活性，這與課題組前期實驗結果相一致[8]。

而mPTP開放促使游離的B細胞淋巴瘤因子相關X蛋白(Bax)位移、結合Bcl-2，從而阻止Bcl-2蛋白激活，促進細胞凋亡[15]。而且Bcl-2蛋白對正常細胞的自身穩定性起重要作用，其高表達可以調控mPTP開放所釋放的Cytc，抑制神經元凋亡[5]。因此針對Bcl-2蛋白繼續研究，實驗中SAMP8組小鼠的線粒體Bcl-2蛋白顯著下調，而針刺后Bcl-2蛋白上調，且趨向SAMR1組。由此，可說明“三焦針法”通過上調SAMP8組小鼠中低表達的Bcl-2蛋白，從而抑制mPTP活性、阻止mPTP開放。有實驗表明針刺可下調Bax蛋白表達量、 增加Bcl-2蛋白進而抑制細胞凋亡，推測與針刺調控mPTP活性有關，這也與實驗結果大體一致[16]。

采取TUNEL法檢測小鼠大腦神經元細胞凋亡情況，其結果顯示SAMP8組小鼠海馬、皮層較SAMR1組相比，IHS評分有明顯升高趨勢，說明AD的發生確實與細胞凋亡過度有關。而針刺組小鼠海馬、皮層細胞凋亡IHS評分較SAMP8組有明顯下降，證明“三焦針法”能夠抑制過度的細胞凋亡。綜上可說明“三焦針法”通過上調Bcl-2蛋白表達、抑制mPTP活性從而阻止mPTP開放，最終達到抑制AD細胞凋亡的目的。

本研究發現非穴位組雖可降低小鼠mPTP活性，但效果明顯低于針刺組，說明腧穴是具有特異性的，同時也證明了“三焦針法”的優越性。此外，僅從本研究只能夠說明三焦針法可以改善AD細胞凋亡情況，因此筆者將進一步研究，以期更全方位深層次探究“三焦針法”在AD細胞凋亡中的作用。

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