HPLC法測定喹乙醇預混劑中喹乙醇的含量

周芷錦，包愛情，陸春波，林仙軍，陳曉林(浙江省獸藥飼料監察所，杭州311101)

喹乙醇是1965年由法國拜耳Bayer公司首先發現了它對動物的促進生長作用，于70年代開發的生長促進劑[1]。由于喹乙醇較強的促生長作用，喹乙醇一度被廣泛使用。但研究表明喹乙醇有中度至顯著的蓄積毒性，對大多數動物有明顯的致畸作用，對人也有潛在的致畸形、致突變和致癌作用[2-3]，因此喹乙醇在美國和歐盟都被禁止用作飼料添加劑，《中國獸藥典獸藥使用指南》2010版[4]也明確規定喹乙醇及其制劑不得用于水產養殖。農業部第168號公告[5]中也作了嚴格規定，規定喹乙醇只能用于體重低于35千克的豬，禁止用于家禽及水產養殖。

目前喹乙醇的檢測方法有ELISA[6]、UPLC[7]、LC-MS/MS[8]，均應用于飼料中喹乙醇及動物性食品中喹乙醇殘留量的檢測；吳寧鵬[9]等報道的獸藥中非法添加喹乙醇HPLC-PDA方法的建立則側重在獸藥中非法添加喹乙醇檢測方法的開發，尚無使用高效液相色譜法測定喹乙醇預混劑中喹乙醇的含量的報道。

喹乙醇預混劑收錄于《中國獸藥典》2010版一部[10]，采用紫外分光光度法測定含量，紫外分光光度法具有便捷、準確等優點，但專屬性不強，易受其他化合物影響。

因此，本文研究開發了高效液相色潽法測定喹乙醇預混劑中喹乙醇含量的方法。試驗結果表明該方法簡便、準確可靠、重現性好，能夠有效地控制該產品的質量。

1 材 料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器，美國Waters公司； TU-1810紫外分光光度儀，北京普析通用儀器有限責任公司；XS-205電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 乙腈、甲醇為色譜純，Merck KGaA 公司；其余試劑為分析純；實驗用水為milli-Q 超純水。喹乙醇對照品(中國獸醫藥品監察所，批號：H0061103，含量：99.5%)；喹乙醇預混劑供試品(批號分別為20160101，20160102和20160103，規格均為5%)，由A廠生產；喹乙醇預混劑供試品(批號為201611182，規格為50%)，由B廠生產。喹乙醇預混劑供試品(批號為1630101，規格為50%)，由C廠生產。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調pH為6.0)-乙腈(92∶8，V∶V)；流速：1.0 mL/min；溫度：30 ℃；檢測波長：262 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取喹乙醇對照品約50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺12 mL，振搖約1 min，加入1 mol/L鹽酸溶液12 mL，超聲5 min，冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，作為對照品儲備液(約500 μg/mL)。精密量取適量，用流動相稀釋成50 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取喹乙醇預混劑適量(約相當于50 mg喹乙醇)，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺12 mL，振搖約1 min，加入1 mol/L鹽酸溶液12 mL，超聲5 min，冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，過濾，精密量取續濾液5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例制備不含喹乙醇的陰性對照樣品，再按2.2.2方法制備成陰性對照溶液。

2.3 系統適應性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入液相色譜儀，進行200～400 nm波長掃描，記錄喹乙醇的光譜圖(圖1)；同時記錄對照品、樣品、陰性樣品的色譜圖(圖2)。該色譜條件下，喹乙醇峰型較好，理論塔板數大于10000。陰性樣品在混合對照品色譜圖相應的位置上無吸收峰，表明處方中的其他輔料對測定結果并無干擾，滿足定量檢測需要。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 精密量取喹乙醇對照品貯備溶液(約500 μg/mL)適量，用流動相稀釋成5、10、20、50、100 μg/mL的系列對照品溶液，按上述色譜條件，精密量取10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積積分值(Y)對濃度(X，μg/mL)進行線性回歸計算，方程為：Y=60928X+8480(R2=1.0000)，線性范圍5～100 μg/mL。結果表明在線性范圍內，喹乙醇濃度與峰面積呈現良好的線性關系。

圖1 對照品光譜圖Fig 1 The spectrogram of olaquindox

圖2 對照品(A)、樣品(B)和陰性樣品(C)的色譜圖Fig 2 The chromatogram of the reference substances(A), the sample(B)and the negative sample(C)

2.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液(50 μg/mL)10 μL,按上述色譜條件，連續重復進樣6次，記錄峰面積，計算結果，喹乙醇峰面積的RSD為0.3%,表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號201611182)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL，記錄色譜峰面積，計算喹乙醇峰面積的RSD為0.6%。結果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批供試品(批號201611182)，分別稱取6份，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中喹乙醇的含量。結果測得喹乙醇的含量分別為518.6、510.4、507.9、507.1、508.1、513.9 mg/g；RSD為0.9%。結果表明此方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的喹乙醇預混劑(批號201611182，含量503.7 mg/g) 50 mg，各6份，置100 mL棕色量瓶中，按照80%，100%和120%三個水平，分別精密加入20 mg、25 mg、30 mg喹乙醇對照品，其余按2.2.2項同法處理后，測定并計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n=6)Tab 1 Results of recovery tests (n=6)

2.4.6 耐用性 研究比較了Waters Symmetry(4.6 mm×250 mm，5 μm)C18柱和Aglinet XDB(4.6 mm×250 mm，5 μm)C18柱，結果表明兩者均完全滿足喹乙醇預混劑的含量測定；對流動相pH值進行了考察，將水相用三乙胺調節pH至5.7，6.0和6.3進行試驗，結果表明pH微小變化基本不產生影響；對溫度進行了考察，選擇25 ℃，30 ℃和35 ℃進行試驗，結果表明溫度僅能影響出峰時間，對峰形和理論板數均無顯著影響；對流動相有機相比例進行考察，調整有機相∶水相為91∶9，92∶8和93∶7(V∶V)，結果表明除出峰時間有微小變化外無顯著差異。綜上所述，建立的方法具有較好的耐用性。

2.5 實際樣品測定 取不同批號的喹乙醇預混劑，按2.2.2項下方法處理，按上述色譜條件進行測定，計算樣品中喹乙醇的含量，并與《中國獸藥典》2010年版一部紫外方法進行比較，結果見表2。表中除批號為1630101的樣品外，其余幾批紫外分光光度法與液相法結果基本一致。而批號為1630101的樣品正是由于添加了喹烯酮，導致使用紫外分光光度法檢測時，喹烯酮與喹乙醇信號疊加，增強了響應，該研究已經由陸春波等人[11]發表論文做了專門的研究，在此不再贅述。

表2 樣品含量測定結果(標示量/%,n=5)Tab 2 Results of content determination of samples (labelled amount/%, n=5)

3 討論與小結

3.1 方法條件優化

3.1.1 波長的選擇 在波長選擇上，通過二極管陣列檢測器(DAD)在200～400 nm進行了全掃描，結果顯示喹乙醇在261.5 nm和375.6 nm的波長處有最大吸收(圖1)，且261.5 nm波長處響應更大，因此采用262 nm作為檢測波長。

3.1.2 提取溶劑的選擇 在提取溶劑上，因為喹乙醇在甲醇等常用溶劑中溶解性差，在N,N-二甲基甲酰胺中溶解性較好，且部分喹乙醇預混劑中含碳酸鈣等輔料，因此沿用《中國獸藥典》2010年版一部，使用N,N-二甲基甲酰胺和1 mol/L鹽酸溶液提取樣品。

3.1.3 流動相的選擇 比較了水-甲醇(90∶10)，水-乙腈(90∶10)，0.02 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈(90∶10)等流動相，結果表明上述流動相均導致喹乙醇峰峰形不夠尖銳，在優化的流動相下，喹乙醇峰峰形尖銳，理論板數高，因此選用研究優化的流動相。

3.2 小結 研究建立了HPLC法測定喹乙醇預混劑中喹乙醇的方法。原標準采用紫外分光光度法測定，雖然具有簡便高效的優勢，但專屬性較差，易受其他化合物干擾，液相方法則較好地解決了該問題。檢測到一批采用紫外方法測定合格而用試驗方法測定不合格的樣品，充分說明開發液相方法的必要性。在合格樣品的測定上，建立的方法與原紫外分光光度法相比，結果基本一致，且方法專屬性強、簡便、準確、重現性好，能夠有效地控制該產品的質量。

[1] Linton A H, Hedges A J, Bennett P M. Monitoring for the development of antimicrobial resistance during the use of olaquindox as a feed additive on commercial pig farms[J]. The Journal of Applied Bacteriology, 1988, 64(4): 311-327.

[2] Chen Q, Tang S, Jin X, Zou J,etal. Investigation of the genotoxicity of guinocetone, carbadox and olaquindox in vitro using vero cells[J]. Food and Chemical Toxicology. 2009, 47(2): 328-334.

[3] Zou J J, Chen Q, Jin X,etal. Olaquindox induces apoptosis through the mitochondrial pathway in HepG2 cells[J]. Toxicology,2011,285(3): 104-113.

[4] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南 2010年版化學藥品卷[S].

Commission of Chineses Veterinary Pharmacopoeia. Guide to Utilization of Veterinary Drug in Veterinary Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2010, Chemical Medicine Volume.

[5] 農業部.農業部第168號公告[S].

Ministry of Agriculture. No.168 Bulletin of The Ministry of Agriculture of The Pepole's Republic of China[S].

[6] 何方洋, 郗日沫, 馮才偉, 等. 喹乙醇藥物ELISA檢測方法的建立[J]. 畜牧與獸醫, 2011, 43(6): 56-60.

He F Y, Xi R M, Feng C W,etal. Determination of olaquindox by ELISA[J]. Animal Busbandry & Veterinary Medicine, 2011, 43(6): 56-60.

[7] 劉 淳.超高效液相色譜測定豬肉中喹乙醇的殘留量[J]. 分析儀器, 2015, (2): 44-47.

Liu C. Determination of olaqunindox residue in pork by ultra high performance liquid chromatography[J]. Analytical Instrumentation, 2015, (2): 44-47.

[8] 易錫斌, 裘立群, 劉世琦, 等. 液相色譜-串聯質譜同時測定禽肉組織中鹽酸金剛烷胺、鹽酸金剛乙胺、地塞米松、替米考星及喹乙醇代謝物的殘留量[J]. 分析測試學報, 2015, 34(3): 346-351.

Yi X B, Qiu L Q, Liu S Q,etal. Simultaneous determination of amantadine hydrochloride, rimantadine hydrochloride, dexamethasone, tilmicosin and olaquindox metabolite residues in poultry tissues by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2015, 34(3): 346-351.

[9] 吳寧鵬, 王麗景, 李慧素, 等. 五種獸藥中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹的HPLC-PDA：檢測方法的建立[J]. 中國獸藥雜志，2014, 48(12): 43-49.

Wu N P, Wang L J, Li H S,etal. Determination of olaquindox and mequindox illegally added in five kinds of veterinary drug by HPLC-PDA[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2014, 48(12): 43-49.

[10] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典 2010年版一部[S].

Commission of Chineses Veterinary Pharmacopoeia. Veterinary Pharmacopoeia of People's Republic of China, 2010 edition, Part1[S].

[11] 陸春波, 高三玉, 羅成江, 等. HPLC-DAD法檢測喹乙醇預混劑中違規添加喹烯酮的研究[J]. 中國獸藥雜志, 2017, 51(3): 61-64.

Lu C B, Gao S Y, Luo C J,etal. Determination of quinocetone into olaquindox premix by HPLC-DAD[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2017, 51(3): 61-64.