近代顯微成像技術的研究進展與應用

狄伶

上海交通大學 分析測試中心，上海 200240

引言

顯微成像技術是一種借助物理方法觀察微小物體的技術手段，它的發展與物理學領域對光的認識密不可分。1837年，德國科學家Abbe[1]揭示了遠場光學顯微鏡在光的衍射效應和有限孔徑分辨率的制約下能夠獲得的最小分辨率不超過200 nm，這一衍射極限使傳統的光學顯微鏡無法對微小物體進行更精微的觀察。在近代生命科學領域，尤其是神經生物學和遺傳發育等學科，備受關注的生理活動更多發生在幾個到幾百納米水平，很多亞細胞器、細胞結構、生物大分子以及細胞膜內部的生理活動很難被傳統的光學顯微鏡捕捉到。盡管改變光源可以大幅提升分辨率，但由此發展出的電子顯微成像技術只適于觀察已被固定的物體，無法實時觀察活的生命現象。為了在生命領域得到更真實的觀察，借助計算機技術聯用光電技術的飛速發展，激光掃描共聚焦顯微鏡以及各種超分辨顯微成像技術逐漸被開發，這些技術不僅在分辨率上實現了對衍射極限的突破，更在多維度上實現了對生命現象的實時動態捕捉，成為分子細胞生物學領域，尤其是神經生物學、遺傳學、生態學和生理學等學科的重要觀察手段[2-4]。

本文主要介紹顯微成像技術中的熒光成像、共聚焦顯微成像和超分辨顯微成像技術；在超分辨顯微成像技術部分，主要介紹受激發射損耗（Stimulated Emission Depletion，STED）技術。

1 光學顯微成像

1.1 常用顯微技術

顯微鏡根據成像方式可以分為光學顯微鏡、共聚焦顯微鏡和體視顯微鏡[5]，其中體視顯微鏡因為在觀察過程中可使用器械微操作又被稱作解剖鏡，在實驗室中常被用于樣品的前處理，例如植物組織（花蕊、花藥）的剖出等。光學顯微鏡和共聚焦顯微鏡廣泛應用于近代生命科學領域，觀察并記錄各種生命現象，由此發展出一系列有學科針對性的顯微成像技術：借助結構光和圖像的重構算法得到超高分辨圖像的結構光照明顯微技術（Structured Illumination Microscopy，SIM）可以開展活細胞的超高分辨觀察[6-7]；使用熒光共振能量轉移技術和生物發光共振能量轉移技術可以動態的檢測蛋白質相互作用[8]；使用多光子顯微成像技術可獲得厚樣本的三維成像，例如捕捉腦組織深層神經元及軸突的空間分布[9]。

基于光學顯微鏡的常用顯微成像技術有：明場成像、暗場成像、偏光成像、熒光成像、相襯成像、微分干涉成像和調制對比成像等?；诠簿劢癸@微鏡的常用顯微技術有：熒光成像、全內反射成像、超分辨顯微成像和多光子顯微成像等。明場成像、暗場成像、偏光成像和熒光成像主要反映形貌信息，而相襯成像、微分干涉成像和調制對比成像主要反映標本結構中的相位變化[4]。全內反射成像主要用于觀察位于或接近細胞質膜的變化[10]；多光子顯微成像在深度觀察方面優于單光子；而超分辨顯微成像在分辨率要求比較高的實驗中更有優勢[11-12]。在所有技術中，熒光成像是最常用的成像技術。

1.2 熒光成像

熒光成像是一種落射光照明的成像技術，光源通常為汞燈或發光二極管，熒光光源通過落射照明光路由分光棱鏡入射到物鏡，然后由濾光片濾出一定波長的激發光激發樣品產生熒光，熒光再經截止濾光片阻擋，只濾出一定波段的熒光返回物鏡通過鏡筒透鏡成像。由于激發光和被激發熒光之間有波長差，使得截止濾光片可以選出被激發熒光，同時截止激發光[4]。

使用熒光成像技術的樣品需要滿足一個基本條件，即樣品待觀察部位能被一定波長的光激發出熒光。常規做法是選擇合適的熒光染色劑（染料）對樣品待觀察的部位進行熒光標記，使用單一染料或聯合多種染料標記出待觀察部位。如果樣品本身存在自發熒光，需要在選擇熒光染料時多加考慮，盡可能避開不想觀察區域自發熒光的干擾。在染料的選擇和使用中，尤其是進行多重標記時，要盡量避免染料之間串色，使用不同種屬來源的抗體進行染色時優先選擇穩定性和抗淬滅性強的染料。目前市場上有很多技術成熟的染料公司可供選擇，比如Sigma公司。各大儀器公司的主頁也會有相應的染料光譜數據以供參考。在做特殊要求的實驗時，比如超高分辨觀察，使用技術研發團隊自行開發的染料將獲得更高的成像效果和分辨率。

2 共聚焦顯微成像

2.1 單光子（共焦）顯微成像

單光子（共焦）顯微成像技術中，所謂單光子就是用一個光子激發一個熒光分子，激發光波長一般短于發射光波長，而多光子是用兩個或多個光子激發一個熒光分子，激發光波長要長于發射光波長。在日常工作中，共聚焦顯微成像系統最常配備的激光器是單光子激光器，最常用的熒光激發方式是單個光子激發，因此我們通常所說的共聚焦顯微成像就是單光子（共焦）顯微成像。多光子激光器可以獨立配置于一臺共聚焦顯微系統上，也可以和單光子激光器共同配置于共聚焦上，使用時由常用的單光子模式切換到多光子模式， 即可開展多光子（共焦）顯微成像觀察。單光子（共焦）顯微成像技術與多光子（共焦）顯微成像技術的主要區別在于使用的激光器不同，成像系統和圖像采集系統都基于共聚焦顯微成像系統，因此這兩個成像技術都屬于共聚焦顯微成像技術體系，具有共聚焦顯微成像系統的優勢。

對于光學顯微鏡來說，深度成像和提高分辨率很難同時實現，尤其在高倍率下這一矛盾更為突出，共聚焦顯微成像系統的點光源優勢和對非焦平面散射光的屏蔽作用可以很好的解決這一問題。共聚焦顯微成像系統的光源是激光，相比光學顯微成像系統的普通光源它的單色性和相干性更好，激光光束沿光路以點對點的掃描方式逐一聚焦于樣品焦平面某點，激發樣品發射熒光，發射光經檢測針孔被光電倍增管所采集，最后由計算機轉化形成熒光圖像[5,12]。這種點對點的掃描方式和針孔對非焦平面以及焦平面上的非焦點光斑信息的阻隔，能有效提高圖像在各深度下的分辨率和清晰度。共聚焦掃描系統沿z軸上下移動形成的一系列共焦平面，經軟件整合為三維圖像，還能更加立體直觀的呈現樣品深層信息，例如特殊合成的小分子或具有靶向性/特異性的物質進入細胞，通過三維重構可以直觀的看到材料在亞細胞器不同焦平面和部位的分布，判斷材料是否進入或僅表覆于亞細胞器。

熒光強度與特異性熒光標記蛋白的表達量成正相關，可以通過分析樣品的熒光強度實現定量分析（圖1）。使用多位點長時間序列掃描，可以動態記錄活細胞生理過程，例如藥物對亞細胞器的靶向實驗中，藥物分子進入細胞的變化曲線、藥物分子與亞細胞器的空間分布以及細胞活性狀態的變化可以在一次觀察中獲得。多位點采集可以在統計學意義上提高數據的可靠性。對于比較大的樣本，例如植物組織或小鼠腦片，使用自動拼接功能結合z軸層掃，可以得到整個樣本的立體信息，獲得更豐富的有效信息。

圖1 熒光定量分析

2.2 多光子（共焦）顯微成像

在腦神經科學和植物學等領域，對樣本實現深度觀察是一個最基本的實驗要求[13]。常用的光學顯微鏡和共聚焦顯微鏡受限于光源很難實現深度超過100 μm的觀察，多光子顯微成像技術采用長波激發光（穿透深度比單光子激光器深）[14]，以脈沖激光的方式使兩個或多個光子同時到達被激發的電子，穿透深度可達1 mm，因此在實現組織深層次成像方面有很大的優勢。結合樣品的透明化處理，多光子顯微成像可以得到很好的成像效果，例如上海交通大學李小衛等[12]研究的透明腦塊三維重構圖（圖2）可以提供樣本深處神經元和軸突的分布及走向，進行直接分析。

圖2 透明腦塊三維重構圖

在實際的工作中，多光子顯微成像系統觀察的樣品一般都比較大、厚或是動物等個體級別，正置的顯微成像系統相對于倒置的顯微成像系統會更有優勢一些，尤其在開展小動物活體實驗時，麻醉小鼠安放在正置顯微成像系統下更便捷，小鼠腦部的開放創口也更易于被固定，保持實驗過程中被激光照射后穩定不動。此外，在材料科學部分領域，尤其是合成藥物分子等研究方向，材料自身的激發光譜較寬，材料對長、短波長的需求各異。檢測平臺或實驗室內常配的單光子激光器波長范圍一般在405～775 nm，材料很難得到充分激發。常配的多光子激光器波長范圍一般在680～1080 nm并且連續可調，可以很好的滿足長波長激發光的需求。根據雙光子的激發原理，被激發的熒光分子同時吸收兩個長波長的光子后發射出一個波長較短的光子，這個效果與使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的，也就是說采用兩倍單光子激發波長也可達到激發條件，這就可以很好的滿足需要波長較短的材料。在觀察時對兩倍單光子激發波長左右一段范圍內逐一激發再確認，或者在這段范圍內進行光譜掃描，可以找到最優的激發波長?；旧线@類寬范圍激發光譜的材料都能使用多光子獲得較好的實驗結果，因此多光子顯微成像也逐漸被越來越多的材料科學所關注并使用。活體動物雙光子顯微成像，見圖3。

圖3 活體動物雙光子顯微成像

3 超分辨顯微成像

光學衍射極限的概念基于光的波動本性，遠場光學顯微鏡受限于光學衍射極限，分辨率僅能達到可見光波長的一半左右（約200 nm），而對于生命科學領域所關注的生理活動，往往需要分辨率達到幾十納米甚至更微小。為了提高分辨率，早期的研究主要集中在對光源和光學物理元件的探索，例如減小光的波長（典型代表是電子顯微鏡）、使用共焦小孔減小艾里斑尺寸（典型代表是共聚焦顯微鏡）、設計更為復雜的光學收集系統增加有效孔徑角（典型代表是4Pi顯微鏡）等。近代對于光學顯微技術的探索，主要借助于光與物質相互作用中產生的各種效應[15]。2014年美國Eric Betzig/William E. Moerner的光激活定位顯微技術（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）及異曲同工的德國Stefan W. Hell的STED技術同獲諾貝爾獎，突破了光學顯微成像的衍射極限并革新了超分辨顯微成像術的歷史[16]。

目前超分辨顯微成像技術主要分為兩類[17-23]：一類是基于調制照明光斑以縮小系統的點擴散函數的超分辨技術：其代表是STED技術以及在STED技術基礎上進一步延展的可逆飽和光熒光轉移顯微技術和基態損耗技術；另一類是基于單分子定位的超分辨顯微成像技術：主要代表是PALM技術、隨機光學重建顯微技術、以及熒光活化定位顯微技術。除了這兩類主流的超分辨顯微成像技術，還有一類重要的活細胞超分辨顯微成像技術，它是基于結構照明原理的SIM技術。

目前，這些超分辨顯微成像技術已由各大顯微鏡品牌公司應用于各自的產品中，而STED技術的發明人Stefan Hell教授團隊自創顯微鏡品牌公司Abberior Instruments，獨立開發并不斷拓展、更新這一技術在實際工作中的應用。關于STED技術，我們可以理解為兩束具有同軸光路的激光共同作用于一個位點，一束用于激發熒光物質得到熒光（圓斑狀），另一束環狀激光使圓斑外周部分區域受激發射（圓環狀），中心無重合的熒光區域被采集，兩束激光重合的受激發射區域被濾光片阻擋，從而獲得尺寸更小的光斑。這個技術通過控制環狀激光的大小提升分辨率，當無重合區域足夠小時，分辨率能得到極大的提高。配合白激光的使用，xy平面分辨率可以達到50 nm以下，z軸分辨率130 nm以下，比共聚焦的分辨率有顯著提升，能夠獲得更多有效科學信息（圖4）[24-25]。

圖4 電紡絲顯微成像圖

Abberior團隊近年在STED技術基礎上繼續開發的超分辨顯微成像系統在分辨率上有進一步提高，XY平面分辨率可以達到20 nm以下，Z軸分辨率30～45 nm以下，3D分辨率可達到70 nm×70 nm×70 nm，稍有遺憾的是這一技術暫時無法開展時間序列掃描。

4 總結

顯微成像技術隨著學科交叉的日益密集在不斷發展，一系列具有學科針對性的特色技術逐漸被開發并使用。操作系統的設計更加便捷，使更多不同學科背景的科研工作者能夠快速掌握并開展工作。圖像的采集和分析更貼近學科和研究方向，使檢測數據結果不僅簡明直觀，而且具有統計學意義。技術層面更加深入解決科研需求，使觀察得以更微小、采集得以更快速、探索得以更深層、捕捉得以更穩定持久。多學科背景研發團隊的融合，從染料研發到顯微成像系統的開發，從后續算法解析到平臺控制軟件，包括系統對環境的適應性，都在進一步被關注并完善，21世紀的顯微成像技術必將為各學科的發展做出更大的貢獻。

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