Cobase602全自動免疫分析儀檢測胃泌素釋放肽前體的性能分析

林麗珍，王建偉，鄭欽欽

(1、廈門大學附屬福州市第二醫院檢驗科，福建 福州 350007；2、福建省立醫院南院福建省立金山醫院檢驗科，福建 福州350008)

小細胞肺癌(SCLC)生長迅速，易復發及早期轉移，而對放療和化療敏感，因此，對其早期診斷和合理治療尤為重要[1-4]。神經元特異性烯醇化酶(NSE)是公認的SCLC腫瘤標志物，已應用于臨床多年。血清胃泌素釋放肽前體(ProGRP)是目前應用較活躍的新的SCLC腫瘤標志物，正逐步用于臨床[4，5]。 酶聯免疫吸附試驗（ELISA)是 ProGRP 相對經典的檢測方法，隨著技術的不斷革新，電化學發光檢測ProGRP正被廣泛應用。采用電化學發光法，可以及時檢測，自動化程度更高，減少人工誤差，同時可大大縮短檢測時間[6]。根據ISO15189醫學實驗室認可標準[7，8]，必須對其檢測系統進行性能評價，本文通過分析其精密度、線性、回收率、參考范圍等，從而評價該法對ProGRP檢測的性能。

1 材料與方法

1．1 標本來源 來自2016年5月13日至5月17日福建省立金山醫院免疫實驗室接收的23份我院國內體檢健康人血清標本。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 試劑 胃泌素釋放肽前體檢測試劑盒（批號：190275）、胃泌素釋放肽前體定標液（18819）、胃泌素釋放肽前體質控液（低水平批號：186304，高水平批號：186305），試劑均來自上海羅氏診斷產品有限公司。

1．2．2 儀器 Roche Cobase602全自動免疫分析儀（上海羅氏診斷產品有限公司）。

1．3 檢測方法

1．3．1 精密度評價 按照CLSI EP15-A2標準：2個濃度水平，5d實驗，每天一批，每批每個水平重復測定3次。

1．3．2 線性評價 選擇低濃度(L)和高濃度(H)患者標本各1份，濃度覆蓋儀器說明書給出的線性范圍，H和L按等比關系配制形成系列濃度血清（ 如 ：1L，0．8L+0．2H，0．6L+0．4H，0．4L+0．6H，0．2L+0．8H，1H）。每個實驗樣品在檢測系統上重復測定2次，記錄結果。將實測值與預期值作比較。采取平均斜率來確定系列樣品應含有的待測物的預期值(X)，所有樣品重復測定的均值為實測值(Y)，將所有結果點在X-Y坐標圖上，計算回歸方程：Y=bX+a。1．3．3 回收率 選擇一患者標本 （濃度為 28．6pg/ml）為基礎樣本，取 900μl基礎樣本和 100μl蒸餾水作為對照樣本，分別取900μl基礎樣本、10μl濃度為224Pg/ml和90μl蒸餾水作為回收樣品1；取900μl基礎樣本、60μl濃度為 224Pg/ml和 40μl蒸餾水作為回收樣品2；取900μl基礎樣本、90μl濃度為224Pg/ml和10μl蒸餾水作為回收樣品3。每份樣品在檢測系統上測定2次，取平均值。根據以下公式計算回收率：回收率=回收濃度/加入濃度×100%；回收濃度=最終測定濃度-基礎樣本濃度；加入濃度=標準品濃度×標準品體積/（標準品體積+基礎樣本體積）[9]。

1．3．4 參考區間 參考 NCCLSC28-A2， 通過測定23份我院國內體檢健康人血清標本，對＜69．2Pg/ml的生物參考區間進行驗證；若20份標本的檢測結果均在參考區間內或僅有2個標本超出，則驗證通過。否則，進行參考區間確立實驗。

1．4 統計學方法 所有統計學處理均在SPSS 20．0統計軟件包以及EXCEL表格上進行。線性評價中，計算出回歸方程：Y=bX+a。若相關系數r≥0．975，b 在 0．95～1．05 范圍內，a 接近于 0 （小于高值標本濃度的1%），則可判斷線性范圍；若a不接近于 0，則做 a 與 0 差異的 t檢驗，若 t＜t(0．05，v)，v=n-2，說明截距是由統計引入的，實際的標準曲線能通過原點，該測定方法在實驗涉及的濃度范圍內呈線性。

2 結果

2．1 精密度驗證 低、高水平樣本檢測的批內精密度均＜1/4TEa，批間精密度均＜1/3TEa。該檢測方法的批內及批間精密度均符合廠家要求小于10%（見表 1）。

表1 精密度驗證結果

2．2 線性范圍驗證 ProGRP 在 10．59～1565．5pg/ml范圍內具有良好線性關系 （廠家線性范圍3～5000Pg/ml），R2=0．9975，b=0．985 在 0．95～1．05 范圍內；a=5．086，經t檢驗顯示 a與 0無顯著性差異（P＞0．05)(見表 2，如圖 1)。

2．3 回收實驗 根據相關公式計算的檢測平均回收率為 100．8%（見表 3）。

2．4 參考區間 參考區間為＜69．2Pg/ml。其中23份標本全部在該參考范圍內，所檢測的結果100%在參考范圍之內，大于允許值90%，因此我室目前的參考范圍經驗證可用。（見表4）

表2 線性范圍驗證結果

表3 回收實驗結果

圖1 線性驗證數據散點圖

3 討論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，具有惡性度高、發病快等特點。小細胞肺癌占肺癌的20%～25%，是一種未分化、惡性程度高、病因復雜的惡性腫瘤，其生長迅速，易早期轉移，且對放療和化療高度敏感，SCLC的早期診斷是提高療效的關鍵。然而早期SCLC缺乏特異性癥狀和體征，影像學檢查在SCLC早期診斷中具有很大的局限性。SCLC相關血清腫瘤標志物檢測具有較高的靈敏度，血液標本易獲取和無創等特點，在SCLC的診斷及治療過程中日益受到重視[10，11]。神經元特異性烯醇化酶(NSE)作為SCLC標記物，其應用于臨床診斷已多年，但在局限性SCLC診斷中，常出現陽性率過低，標本易受溶血、脂血影響[12，13]。胃泌素釋放肽前體（ProGRP）是目前應用較活躍的一種新的小細胞肺癌腫瘤標志物，其敏感性、特異性和可靠性均優于NSE，作為診斷小細胞肺癌最明確的指標正逐步用于臨床。

表4 參考區間驗證結果

ProGRP是胃泌素釋放肽（GRP）的前體結構。而GRP和ProGRP在腫瘤的發生、發展及其治療中起著重要的作用。ProGRP顯示GRP水平和GRP基因表達，是SCLC的一種新的腫瘤標志物，在國內外已經得到廣泛應用。由于SCLC具有神經內分泌腫瘤的性質，因此ProGRP和NSE在SCLC的診斷中具有良好的診斷價值[14，15]。酶聯免疫吸附試驗（ELISA)檢測ProGRP相對經典的檢測方法，然而由于手工方法加樣、洗滌，溫育、制作標準曲線等操作步驟多，則重復性較差，人為誤差較大，這就迫切需要革新技術，全自動電化學發光應運而生。在Cobase602全自動化免疫分析儀上用電化學發光法檢測檢測胃泌素釋放肽前體（ProGRP)重復性好，人為誤差小。

對檢測系統或檢測方法進行性能評價是臨床檢驗質量管理的重要內容。精密度是反映檢測系統整體性能的首要指標，也是進行其他方法學驗證實驗的前體[16]。本研究精密度評價實驗按照EP15-A2文件進行，實驗數據顯示在Cobase602全自動化免疫分析儀上用電化學發光法檢測檢測胃泌素釋放肽前體（ProGRP)，其低、高水平批內精密度均＜1/4TEa，批間精密度均＜1/3TEa，均小于廠家聲明的最小CV。線性評價實驗根據CLSI EP6-A文件，采用簡便的平均斜率法，結果顯示在Cobase602全自動化免疫分析儀上用電化學發光法檢測檢測胃泌素釋放肽前體 （ProGRP)，在3-5000Pg/ml范圍內具良好線性關系 （Y=0．9854X+5．0860，R2=0．9975），達到廠家的檢測聲明。 在定量分析驗證時，準確度通常可用回收率表示，回收率越接近100%表明分析方法準確度越高。本研究回收實驗結果顯示，基于磁珠法的HBVDNA檢測回收率為100．8%，接近100%，準確度高[17]。根據NCCLSC28-A2， 參考區間為＜69．2pg/ml驗證試驗通過。總之，在Cobase602全自動化免疫分析儀上用電化學發光法檢測檢測胃泌素釋放肽前體（Pro-GRP)，實現了快速縮短檢測時間、重復性好、人為誤差小，具有良好檢測性能，適合臨床實驗室推廣使用。

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