胎兒頸項透明層厚度與染色體異常的相關(guān)性研究

馬 瑩,陳 奕

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026)

胎兒頸項透明層(nuchal translucency，NT)是早孕晚期胎兒頸后皮下液體積聚，超聲征象表現(xiàn)為頸后無回聲區(qū)。通過超聲測量孕11～13+6周胎兒的NT厚度，預(yù)測胎兒染色體畸變及其他異常的風險，進一步通過介入性產(chǎn)前診斷，利用分子生物學或細胞遺傳學方法分析胎兒染色體的情況，可降低出生缺陷。隨著我國計劃生育政策的改變，高齡產(chǎn)婦增多，如何積極有效地早期預(yù)測胎兒染色體異常，提高出生人口質(zhì)量的同時降低介入性產(chǎn)前診斷帶來的風險，有必要探討NT增厚程度與胎兒染色體異常的關(guān)系。然而國內(nèi)目前尚無統(tǒng)一的NT增厚標準，當NT 厚度超過第99 百分位數(shù)(即3.5mm)時斷定NT增厚無爭議，但對NT厚度超過第95 百分位數(shù)(即2.5mm)判斷為NT增厚有爭議。本研究通過分析457例NT≥2.5mm胎兒的染色體結(jié)果，探討NT厚度與胎兒染色體異常的關(guān)系，NT臨界厚度(2.5～2.9mm)的臨床意義，以及低覆蓋度大規(guī)模平行測序技術(shù)(low-coverage massively parallel CNV sequencing, CNV-seq)結(jié)合短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats, STR)檢測對NT≥2.5mm胎兒產(chǎn)前診斷的應(yīng)用價值。

1資料與方法

1.1 研究對象

選取首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院2013年1月至2016年12月孕11～13+6周彩色多普勒超聲檢查，提示根據(jù)國際標準和平面標準測量胎兒頂臀長(CRL)在45～84mm，NT≥2.5mm的在首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診，并接受介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，記錄孕婦的姓名、NT厚度、超聲提示合并結(jié)構(gòu)情況、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing，NIPT)結(jié)果，穿刺方法及染色體結(jié)果。所有研究對象均簽署知情同意書，該項研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 介入性產(chǎn)前診斷

根據(jù)孕婦情況及其知情同意選擇如下方法,①絨毛活檢：孕11～14周經(jīng)腹絨毛活檢;②羊膜腔穿刺：孕18～24周行羊膜腔穿刺。

1.3 染色體的檢測方法

①絨毛細胞或羊水細胞培養(yǎng)及染色體核型分析;②熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)；③CNV-seq結(jié)合STR檢測。北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進行檢測。

1.4 NIPT的檢測方法

經(jīng)檢測前知情同意后，于孕12～20周抽取孕婦外周靜脈血5mL，置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，進行二次離心后提取血漿中的 DNA，制備測序文庫并質(zhì)控，應(yīng)用高通量測序儀進行檢測，將測序結(jié)果生成的數(shù)據(jù)與人類基因組序列進行比對，生物信息分析不同染色體水平的差異，計算出胎兒患21三體、18三體及13三體的風險值，風險值為(-3，+3)之間為低風險，超出范圍為高風險。

1.5 統(tǒng)計學方法

按NT厚度為2.5～2.9mm、3.0～3.9mm、4.0～5.9mm及6.0mm以上分為四組，比較不同NT厚度各組胎兒染色體異常的情況。使用PASW Statistics 18.0軟件，數(shù)據(jù)資料采用描述統(tǒng)計頻率方法計算中位數(shù)，合并結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度與不合并結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度差異比較采用兩獨立樣本的Mann-WhitneyU檢驗，合并結(jié)構(gòu)異常與不合并結(jié)構(gòu)異常胎兒染色體異常的差異采用χ2檢驗，NT厚度四組間差異采用多個樣本率構(gòu)成比的多重比較，進行列聯(lián)表χ2檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，如果進行兩兩比較則對檢驗水準進行校正，以P值低于校正后檢驗水準為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 一般情況

因NT≥2.5mm行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦471例，去除資料不全及檢測失敗者18例，453例孕婦符合入組標準。4例雙胎兩胎兒均NT≥2.5mm，分別行染色體檢查，共納入研究457例胎兒。孕婦年齡19～42歲，中位數(shù)30歲，單胎439例，雙胎14例，NT厚度2.5～13.5mm，中位數(shù)3.5mm。

2.2 其他篩查

入組病例術(shù)前行NIPT提示21三體高風險6例，18三體高風險3例，13三體高風險1例，47XXY 1例，行介入性產(chǎn)前診斷均證實無誤，1例NIPT提示X染色體異常，證實為45X嵌合體，低風險2例，1例無誤，1例雖然核型分析正常但是測序技術(shù)證實有致病性未知的微重復(fù)。

2.3 胎兒結(jié)構(gòu)異常

NT≥2.5mm且超聲提示合并結(jié)構(gòu)異常者55例，包括頸部水囊瘤15例，心臟畸形8例，全身水腫或胸水、腹水21例，鼻骨缺失4例，臍膨出6例，骨骼畸形2例，全前腦1例，巨膀胱1例，單臍動脈5例，脈絡(luò)叢囊腫2例，靜脈導(dǎo)管A波反向1例，其他畸形4例。病例中超聲提示結(jié)構(gòu)異常者NT厚度2.5～13.5mm，中位數(shù)為5.6mm，無結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度2.5～13.0mm，中位數(shù)為3.4mm，分析胎兒結(jié)構(gòu)異常的NT厚度與無結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度差異有顯著性(P<0.001)。NT≥2.5mm且超聲提示合并結(jié)構(gòu)異常胎兒中染色體異常26例(47.3%)，合并結(jié)構(gòu)異常與不合并結(jié)構(gòu)異常比較，胎兒染色體異常的差異有顯著性(χ2=23.012，P<0.001)。超聲提示鼻骨缺失4例中3例為21三體，符合率達75%。

2.4 染色體結(jié)果

核型分析、FISH或兩者聯(lián)合檢測233例，染色體異常43例(18.5%)。包括13三體1例，18三體10例，21三體25例(包括易位型1例)，45X2例，48XXYY及47XXY各1例，嵌合體3例，分別為45X(88)/46XX(12)，47XYY(17)/46XY(83)，XY(150)/XX(50)。

CNV-seq結(jié)合STR檢測 224例，同時行核型分析75例，同時FISH檢測1例，發(fā)現(xiàn)染色體異常及拷貝數(shù)變異( copy number variations, CNVs) 99例(44.2%)，除外未知性及多態(tài)性CNVs，457例胎兒中染色體異常檢出率為22.1%(101/457)。染色體數(shù)目異常49例，包括13三體2例，15三體1例，18三體7例，45X 9例，21三體25例，47XXX 1例，嵌合體4例，分別為45X(80%)/46XX(20%)，47XN,+13(60%)/ 46XN(40%)，47XN,+18(80%)/46XN(20%)，45X(60%)/46XX(40%)，最后1例同時羊水核型分析45X(76)/46XX(24)。CNVs共有50例，包括多態(tài)性15例，未知性26例，致病性9例(4.0%)，致病性9例中5例由于缺失/重復(fù)>5Mb能通過常規(guī)核型分析檢測出來，余4例致病性CNVs片段<5Mb常規(guī)方法不能檢測出來，核型分析出遺傳自母親的染色體結(jié)構(gòu)重排3例，CNV-seq結(jié)合STR檢測未能提示結(jié)構(gòu)重排，其中1例兩者結(jié)合檢測出染色體結(jié)構(gòu)重排伴有致病性未知的CNVs。

2.5 NT厚度與胎兒染色體異常的關(guān)系

按NT厚度2.5～2.9mm、 3.0～3.9mm、4.0～5.9mm及6.0mm以上分四組，每組例數(shù)及胎兒染色體異常例數(shù)分別為87例，3例(3.5%);190例，35例(18.9%)；111例，32例(28.8%)；69例，31例(44.9%)，統(tǒng)計當NT≥3.0mm總的染色體異常率26.5%。隨NT厚度增加胎兒染色體異常率顯著增加，分析四組間差異有顯著性(χ2=42.878，P<0.001)，兩兩比較并校正檢驗水準后第一組和其他各組比較差異均有顯著性(P<0.01)，第二組和第四組比較差異有顯著性(P<0.001)，而第二組和第三組、第三組和第四組比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。NT臨界厚度(2.5～2.9mm)胎兒染色體異常者3例，1例超聲提示鼻骨缺失，2例穿刺術(shù)前行NIPT高風險。

表1 NT厚度組間多個樣本率構(gòu)成比的比較[n(%)]
Table 1 Comparison of the constituent ratio of multiple sample rates among groups with different NT thicknesses[n(%)]

NT分組總例數(shù)(n)胎兒染色體異常比較分析χ2P①2.5～2.9mm873(3.5)與②比較11.303<0.001與③比較21.5900.001②3.0～3.9mm19035(18.9)與③比較4.3860.036與④比較18.729<0.001③4.0～5.9mm11132(28.8)與④比較4.8470.028④6.0mm以上6931(44.9)與①比較38.843<0.001

注：校正檢驗水準后P<0.0083為差異有統(tǒng)計學意義。

3討論

3.1 NT截斷值與NT臨界厚度

已知NT增厚是預(yù)測胎兒染色體異常和多種胎兒畸形的有效超聲軟標記。國內(nèi)研究報道NT≥2.5mm的發(fā)生率占全部胎兒的1.58%[1]， NT厚度為2.5～3.0mm的病例占1.81%， NT≥3.0mm占0.78%[2]。本文統(tǒng)計457例NT≥2.5mm胎兒中染色體異常檢出率為22.1%(101/457)，NT厚度為2.5～2.9mm胎兒的染色體異常率為3.5%，和其他各組比較差異均有顯著性，當NT≥3.0mm染色體異常率為26.5%。前期鄧洪梅等[1]統(tǒng)計我院2012年NT≥2.5mm者為173例，12例染色體異常，NT厚度為2.5～3.0mm的胎兒染色體異常率僅1%(1/100)，而NT≥3.5mm的染色體異常率達16.9%，初步研究出胎兒NT≤3.5mm，孕婦年齡<35歲，唐篩低風險，超聲未提示結(jié)構(gòu)異常，絕大多數(shù)為正常胎兒。一項來自以色列的多中心研究報道，將超聲未提示結(jié)構(gòu)異常的NT病例分為三組，NT≤2.9mm、NT3.0～3.4mm及NT≥3.5mm，以微陣列分析 (chromosomal microarray analysis，CMA) 技術(shù)評價后認為NT截斷值定為3.0mm更為合理[3]。2016年ACOG發(fā)布了163號指南，指出孕11～14周NT≥3.0mm或大于相應(yīng)胎兒頭臀長的99%百分位數(shù)視為NT增厚，并且隨著NT值增厚胎兒非整倍體異常風險增加，建議應(yīng)給予遺傳咨詢，可提供無創(chuàng)DNA檢測或絨毛活檢，并且在孕中期應(yīng)進行詳細的超聲篩查和胎兒心臟超聲檢查[4]，本研究數(shù)據(jù)也證實隨NT厚度增加胎兒染色體異常率顯著增加，與指南一致。但還統(tǒng)計了NT厚度為2.5～2.9mm胎兒的染色體異常率為3.5%(3/87)，3例染色體異常病例中1例超聲提示鼻骨缺失，2例穿刺術(shù)前行NIPT高風險。

依據(jù)復(fù)習文獻和研究結(jié)果本研究認為將NT截斷值定為3.0mm，NT厚度為2.5～2.9mm定為臨界厚度較為合理，當NT≥3.0mm或合并結(jié)構(gòu)異常建議介入性產(chǎn)前診斷。近幾年來隨著NIPT的推廣臨床已經(jīng)證實了其準確度較高，減少由于介入性產(chǎn)前診斷操作帶來的手術(shù)風險，雖然目前NIPT檢測染色體微小異常價值有限，但是其無創(chuàng)性和孕12周后即可進行體現(xiàn)其有良好的篩查價值，應(yīng)重視在早孕期篩查中NT與NIPT的聯(lián)合。國內(nèi)報道NT厚度為2.5～3.0mm的病例占1.81%[2]，還應(yīng)重視此部分NT值(即NT第95 百分位數(shù)至截斷值)胎兒的后續(xù)咨詢。本研究建議當NT為臨界厚度即NT 2.5～2.9mm不合并胎兒結(jié)構(gòu)異常時行NIPT，根據(jù)NIPT的結(jié)果及隨后的中孕期超聲篩查決定下一步處理，如果出現(xiàn)NIPT高風險或中孕期超聲提示超聲軟指標再考慮行介入性產(chǎn)前診斷，可增加介入性產(chǎn)前診斷的檢出率，患者接受度也較高，并同時降低染色體異常兒的漏診。國內(nèi)尚無統(tǒng)一的截斷值標準，此建議需要更多研究。本研究中核型分析發(fā)現(xiàn)嵌合體3例，CNV-seq結(jié)合STR檢測發(fā)現(xiàn)嵌合體4例，其中1例為45X[60%]/46XX[40%]，同時羊水培養(yǎng)核型分析45X[76]/46XX[24]，考慮兩種方法報告嵌合比例不一致的原因可能是羊水培養(yǎng)的細胞發(fā)生了變異。

3.2 NT厚度與拷貝數(shù)變異

致病性NT厚度與CNVs在辨別胎兒染色體疾病方面具有重要作用，目前結(jié)合CMA和染色體核型分析是臨床檢測 CNVs的金標準，可提高染色體異常的檢出率。Maya等[3]報道統(tǒng)計無結(jié)構(gòu)異常的NT≤2.9mm、NT 3.0～3.4mm及NT≥3.5mm病例，對比NIPT及傳統(tǒng)核型分析CMA技術(shù)檢出染色體異常率明顯增高，檢出各組致病性CNVs率分別為1.7%、7.1%,和13.0%，有報道經(jīng)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QF-PCR)檢測結(jié)果正常的122例NT≥3.5mm病例，行CMA檢出致病性CNVs者7例(5.7%)，其中3例由于缺失/重復(fù)<10MB核型分析不能檢測出來[5]，所以對NT增厚的胎兒使用CMA技術(shù)可使致病性染色體畸變檢測率提高。本研究通過CNV-seq結(jié)合STR檢測224例NT≥2.5mm的胎兒，檢出致病性CNVs 9例(4.0%)，4例致病性CNVs缺失/重復(fù)<5MB常規(guī)染色體核型分析不能檢測出來，與上述報道類似，提示對NT增厚的胎兒使用CNV-seq結(jié)合STR檢測可使致病性染色體畸變檢測率提高。

另外本研究核型分析出遺傳自母親的染色體結(jié)構(gòu)重排3例，2例測序技術(shù)無法檢測出，考慮為平衡性重排，兩者結(jié)合檢測出另1例胎兒染色體結(jié)構(gòu)重排伴有致病性未知的CNVs，說明兩者結(jié)合檢測分析染色體結(jié)構(gòu)重排情況更全面。有報道1例NT增厚的胎兒常規(guī)G顯帶分析染色體為45, XX, dic (9;13) (q34;p13)，而CMA分析出9q34.3缺失3.6Mb，并且缺失區(qū)域含有EhMT1基因，在NT增厚但是染色體核型提示結(jié)構(gòu)異常的病例應(yīng)用CMA檢測更為細致[6]，與本研究一致。

3.3 NT厚度與胎兒結(jié)構(gòu)異常

隨著超聲儀器分辨率的不斷提高及超聲工作者經(jīng)驗的不斷積累，早孕期超聲檢查越來越普及和項目細化， 可發(fā)現(xiàn)很多胎兒結(jié)構(gòu)異常，本研究統(tǒng)計頸部水囊瘤及胎兒水腫、胸腹水及心臟畸形是NT≥2.5mm胎兒超聲圖像中最常發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)異常，NT≥2.5mm合并有結(jié)構(gòu)異常的胎兒染色體異常率達47.3%，合并結(jié)構(gòu)異常胎兒的染色體異常率顯著高于非合并結(jié)構(gòu)異常者，鼻骨缺失對21三體的符合率達75%(3/4)，證實鼻骨缺失為預(yù)測21三體敏感性高的超聲指標。王莉等[2]報道孕11～14周超聲檢查發(fā)現(xiàn)可疑胎兒異常28 例，NT≥3.0mm 合并結(jié)構(gòu)異常11 例，19 例NT增厚胎兒中8例合并心臟畸形，提示當發(fā)現(xiàn)胎兒NT厚度異常時應(yīng)仔細篩查結(jié)構(gòu)。本文還發(fā)現(xiàn)胎兒有結(jié)構(gòu)異常的NT厚度顯著高于無結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度，提示NT厚度增加時合并胎兒結(jié)構(gòu)異常的可能性也增加。而2013年Sotiriadis等[7]對20多個NT相關(guān)研究進行Meta分析，染色體核型正常但患有心臟畸形的胎兒中，44%的胎兒NT厚度大于相應(yīng)孕周的第95百分位數(shù)，20%的胎兒NT厚度大于相應(yīng)孕周的第99百分位數(shù)，NT厚度對胎兒心臟畸形有預(yù)測意義。Yang等[8]對220例常規(guī)染色體核型分析正常的NT≥3.0mm胎兒進行比較基因組雜交(ACGH)檢測并結(jié)合孕20～24周的篩畸超聲檢查，在有無結(jié)構(gòu)異常胎兒中比較CNVs情況，發(fā)現(xiàn)9.1%(20/220)的胎兒存在CNVs，且超聲提示結(jié)構(gòu)異常的胎兒CNVs率顯著高于無結(jié)構(gòu)異常的胎兒(26.9% vs 6.7%)，提示NT增厚的胎兒雖然染色體核型正常，但當超聲提示結(jié)構(gòu)異常應(yīng)考慮存在CNVs。因此當超聲提示NT厚度增加和/或發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常時對胎兒染色體異常及CNVs有預(yù)測價值，即使染色體核型正常，也建議增加胎兒超聲心動圖及孕期超聲監(jiān)測和考慮行CMA或CNV-seq檢測是否存在CNVs。

除染色體異常外，淋巴系統(tǒng)發(fā)育遲緩、感染、貧血都可能與NT厚度相關(guān)。本研究認為NT截斷值定為3.0mm，NT厚度為2.5～2.9mm定為臨界厚度較為合理，不合并胎兒結(jié)構(gòu)異常臨界厚度的NT病例可以建議行NIPT，視其結(jié)果及隨后的超聲篩查決定下一步處理，可降低染色體異常兒的漏診。NT厚度增加或發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常時即使胎兒染色體核型無異常也建議增加胎兒超聲心動圖及孕期超聲監(jiān)測，對NT增厚和/或結(jié)構(gòu)異常的胎兒使用CMA或CNV-seq可使致病性染色體畸變檢測率提高。

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