HPV E6/E7 mRNA及HPV L1蛋白表達與宮頸病變的關系及其診斷價值

葉建紅，陳雪紅，包麗麗，劉麗杰

(臨海市第二人民醫院婦產科，浙江 臨海 317016)

近年來，發展中國家宮頸癌的發病率和死亡率呈持續增長、年輕化趨勢，據統計全世界女性常見癌癥中，宮頸癌位居第二，其中有80%的宮頸癌發生在發展中國家[1]。在美國，每年通過宮頸細胞學檢測開展宮頸癌普查項目，致使宮頸癌的發病率和死亡率有所下降。人乳頭瘤狀病毒(human papillo￣maviru，HPV)感染是宮頸癌發生的誘發因素，若能早期發現將有助于減少罹患宮頸癌的風險[2]。然而，HPV DNA檢測特異度較低，與宮頸脫落細胞學聯合檢測的方法費用較高。宮頸上皮細胞中存在致癌基因E6和E7蛋白的過度表達，HPV E6/E7 mRNA是監測HPV感染并預測宮頸病變的重要評估因素[3]。HPV DNA包括2個編碼病毒衣殼蛋白的基因(L1、L2)，HPV L1蛋白檢測陽性說明存在一過性HPV感染階段，HPV L1蛋白的缺失說明HPV感染持續存在或已發生顯著病變。本研究分別對HPV DNA陽性患者的細胞學和組織學標本進行了HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV L1蛋白檢測，以評估兩種方法在宮頸上皮內病變中的診斷價值。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2016年2月至2017年6月在臨海市第二人民醫院行宮頸液基薄層細胞學檢查(thin cytologic test，TCT)的標本，其中經第二代雜交捕獲法檢測HPV DNA陽性127例，年齡20～75歲，平均年齡(38.6±4.3)歲。排除標準：懷孕或近期妊娠史；子宮內膜癌、輸卵管癌、外陰癌或其他惡性腫瘤經放化療后的標本；既往宮頸或子宮切除手術史；HPV無關腺癌或其他腫瘤；免疫系統疾病史。

1.2分組

有103例組織細胞學診斷為宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)，設為研究組；24例組織細胞學診斷為慢性炎癥和正常，設為對照組。單因素方差分析結果顯示，組間一般資料比較無明顯統計學差異(P>0.05)，見表1。

組別組織細胞學診斷例數(n)年齡(歲)研究組CIN12737.7±4.2CIN23238.1±3.9CIN32437.8±4.1SCC2039.1±5.6對照組慢性炎癥+正常2438.5±4.8F0.231P0.442

1.3方法

1.3.1組織細胞學診斷

使用窺陰器充分暴露患者宮頸，滅菌棉球輕輕擦去宮頸分泌物，于宮頸管內及宮頸外口刷取標本，并進行制片，光學顯微鏡下診斷。診斷標準參考國際癌癥協會對宮頸/陰道脫落細胞學的診斷標準。對于診斷異常的患者鏡下取活檢組織，進行病理學診斷，根據組織異形性程度和范圍進行分級。

1.3.2 HPV E6/E7 mRNA的檢測和HPV L1蛋白表達的檢測

各組分別進行HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV L1蛋白表達檢測。采用分支鏈DNA技術進行HPV E6/E7 mRNA檢測，具體操作步驟分為：標本漂洗、標本裂解、緩沖液配置、布板、封板膜密封雜交板、信號放大與檢測、結果判定。

采用免疫組織化學染色技術進行HPV L1蛋白表達檢測：將各組患者宮頸石蠟包埋組織進行切片、脫蠟、水化、抗原修復等操作，以雙氧水消除內源性過氧化物酶活性，血清封閉后加入HPV L1殼蛋白抗體(抗體濃度1:200)，反應過夜后加入二抗(生物素標記山羊抗鼠工作液)，反應后清洗玻片，DAB顯色后，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后鏡下觀察。陽性染色部位位于病變細胞的細胞核中，呈紅棕色。陽性染色標準：發現1個細胞核紅染即為陽性染色。

1.3.3觀察指標

統計各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達情況，計算并比較陽性表達率。統計HPV E6/E7 mRNA和HPV L1兩種檢測方法的符合率。以組織細胞學診斷結果為金標準，比較兩種檢測方法在宮頸病變中的診斷價值(準確度、敏感度、陽性預測值、陰性預測值)。

1.4統計學方法

2結果

2.1各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達情況

研究組HPV E6/E7 mRNA表達陽性率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，研究組間不同級別病變HPV E6/E7 mRNA表達陽性率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)。研究組CIN1 HPV L1蛋白表達陽性率與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。相關性分析結果顯示，組織細胞學診斷級別與HPV E6/E7 mRNA表達陽性率呈顯著正相關關系(r=0.954，P<0.05)；與HPV L1蛋白表達陽性率呈顯著負相關關系(r=-0.976，P<0.05)，各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達情況比較見表2。

表2 各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達情況比較[n(%)]

注：*為對照組與研究組比較，#為對照組與CIN1組比較，★為對照組與CIN2組比較，●為對照組與CIN3組比較(Fisher確切概率法檢驗)，◆為對照組與SCC組比較(Fisher確切概率法檢驗)。

2.2 HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白兩種檢測方法在宮頸病變中的診斷價值比較

各種檢測方法敏感度、特異度有顯著性差異(均P<0.05)，其中聯合檢測敏感度最低，特異度最高。各種檢測方法準確度、陽性預測值和陰性預測值比較無顯著性差異(均P>0.05)，見表3。

表3 不同檢測方法對宮頸病變的診斷價值比較[%(n/N)]

3討論

3.1 HPV E6/E7 mRNA與宮頸病變

HPV感染是宮頸癌發生的誘發因素，HPV可以通過感染宮頸上皮細胞后導致上皮內非典型增生等病理表現，逐漸發展為宮頸癌變[4]。從HPV感染到宮頸癌的發生通常需要一個漫長的過程[5]。HPV DNA檢測彌補了宮頸脫落細胞學檢查的不足，大大提高了宮頸篩查的敏感性，但特異度較低，后者可能是由于大部分女性在感染HPV后可能在幾年內通過自身免疫系統自動清除病毒。目前,將HPV DNA與宮頸脫落細胞學聯合檢測的方法在宮頸癌臨床篩查中普遍開展，雖然提高了診斷的敏感性和特異性，但費用較高。因此尋找一種經濟而有效的HPV陽性預測手段極為重要。

研究證實，HPV有多種亞型，與宮頸癌關系密切的包括14種高危型HPV和10種低危型HPV[6]。在高危型HPV DNA的檢測中發現，宮頸上皮細胞中存在致癌基因E6和E7蛋白的過度表達，能夠促進細胞病變的進展[7]。HPV E6/E7 mRNA為病毒復制和持續感染的生物標志物，是監測HPV感染并預測宮頸病變的重要評估因素[8]。本研究結果顯示，與宮頸組織存在慢性炎癥和正常的病例比較，CIN和SCC的病例存在較高的HPV E6/E7 mRNA陽性表達率(P<0.05)。且相關分析結果顯示，組織細胞學診斷級別越高，HPV E6/E7 mRNA表達陽性率越高(P<0.05)。

3.2 HPV L1蛋白與宮頸病變

HPV分子為雙鏈環狀DNA分子，包括6個與DNA復制及細胞轉化有關的基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和2個編碼病毒衣殼蛋白的基因(L1、L2)。有研究證實，HPV L1 DNA 和HPV L1蛋白表達水平能夠在一定水平上反應細胞中病毒復制狀態，以及宮頸病變的進展[9]。HPV L1蛋白檢測陽性說明存在一過性HPV感染階段，HPV L1蛋白的缺失說明HPV感染持續存在或已發生顯著病變[10]。本研究發現，組織細胞學診斷級別與HPV L1蛋白表達陽性率呈顯著負相關關系(P<0.05)，組織細胞學診斷級別越高，HPV L1蛋白表達陽性率越低。但本研究也發現，研究組HPV L1蛋白表達陽性率與對照組比較無明顯統計學差異，但不難發現，對于組織細胞學診斷級別較高的CIN3和SCC，其HPV L1蛋白表達陽性率低于對照組，但可能由于觀察例數的限制差異無統計學意義(P>0.05)。

為進一步探討HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白兩種檢測方法在宮頸病變中的診斷價值，本研究分別統計了兩種檢測方法及聯合檢測在宮頸病變中的診斷價值。結果發現，各種檢測方法敏感度、特異度有顯著性差異(均P<0.05)，其中聯合檢測敏感度最低，特異度最高。各種檢測方法準確度、陽性預測值和陰性預測值比較無顯著性差異(P>0.05)，表明聯合檢測方法在鑒別宮頸病變時有較高的特異性。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白的表達水平與宮頸病變關系密切，能夠在一定程度上反應病毒致癌能力，聯合檢測較單獨檢測具有更高的診斷價值，可與HPV DNA檢測方法互為補充，具有良好的臨床應用前景。

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