ZNF267在膀胱癌中的表達及其對細胞增殖和轉移的影響

曹正，邱明星

（西南醫科大學，四川 瀘州 646000）

在中國膀胱癌發病率居泌尿生殖系統惡性腫瘤的首位[1-2]。膀胱移行細胞癌（transitional cell carcinoma，TCC）是膀胱癌最常見的類型，部分患者將發展為肌層侵襲性膀胱癌[1-2]。化療可有效控制部分肌層侵襲性膀胱癌，但無法提高大部分患者的生存期[3]。因此，闡明膀胱癌發生、發展的分子機制顯得尤為重要。Kruppel樣因子家族分子可調控多項生理進程[4]。鋅指蛋白267（zinc finger protein 267，ZNF267）是Kruppel鋅指家族成員，研究顯示ZNF267在多種腫瘤中發揮重要作用[5-6]。然而，尚無研究闡明ZNF267在膀胱癌中的表達及其功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1640培養基（美國HyClone公司），青霉素-鏈霉素雙抗（美國HyClone公司），胎牛血清（美國Gibco公司）。逆轉錄及RNA提取試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）所應用的 Real Master試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，FITC標記的Annexin-V及PI抗體（美國Biolegend公司），Tranwell小室（美國Milipore公司），人膀胱癌細胞系T24、BIU87及人膀胱上皮永生化細胞系SV-HUC-1（中國科學院上海細胞庫）。

1.2 主要儀器

液氮灌、細胞培養箱購自美國Thermo公司，ABI 7900型PCR儀（美國ABI公司），BD FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 組織標本 14例TCC組織及配對癌旁組織標本來自西南醫科大學附屬醫院泌尿外科。14例患者在根治性切除術后經病理診斷為TCC。所有入組患者同意本研究使用其組織標本，并簽署知情同意書及授權書。本研究經西南醫科大學附屬醫院倫理委員會批準。標本收集后，儲存于液氮罐中。

1.3.2 細胞培養 人膀胱癌細胞系T24、BIU87，以及人膀胱上皮永生化細胞系SV-HUC-1用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的1640培養基，所有細胞置于37℃、5%二氧化碳CO2細胞培養箱中。

1.3.3 RNA提取 Trizol裂解人TCC組織或細胞系，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取水相層，加入等體積的異丙醇。4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，所得膠狀沉淀即為RNA。

1.3.4 qRT-PCR 采用qRT-PCR反應檢測TCC組織和細胞系中ZNF267的相對表達量，以及ZNF267在TCC細胞中的干涉效率。將RNA逆轉錄為cDNA作為模板。將125μl 20xSYBR溶液加入1.0 ml 2.5x Real Master Mix中，所得溶液作為試劑A。實驗采用20μl體系，內含 9μl試劑 A，1μl 20x ROX Reference Dye，1μl正向引物，1μl反向引物，cDNA模板2μl，6μl去離子水。qRT-PCR反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35個循環。ZNF267正向引物：5′-ATGGGAGCTGTGATCTTGAGA，反向引物：5′-GCAATGATGAATGAGTAAAGACC；β-actin正向引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，反向引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。ZNF267相對表達量 ：2-ΔΔCt=CtZNF267-Ctβ-actin。

1.3.5 CCK-8法 采用CCK-8增殖試劑盒檢測轉染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細胞增殖情況。取對數生長期的人TCC細胞，制備單細胞懸液，以2.0×103個/孔的細胞密度接種于96孔板中，每組實驗設8個復孔，分別培養1～5 d，加入10μl/孔的CCK-8試劑，培養4 h后，在450 nm波長處測定吸光度值，所得數據作為第1天的OD值。而后每天在同一時間再次測定吸光度值，根據5 d內各組所測OD值，繪制細胞增殖曲線。

1.3.6 流式細胞術 采用流式細胞術檢測轉染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細胞周期情況。取對數生長期的人TCC細胞，制備為單細胞懸液。10 ml PBS，1 000 r/min離心10 min，反復洗滌3次，棄上清；若檢測細胞周期，則在各組細胞中加入100μl流式洗液和50μg/ml PI 5μl，或同型對照抗體，避光反應15 min。采用尼龍膜過濾細胞，除去細胞團塊后，立即用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測。若檢測細胞凋亡，則在清洗細胞后加入FITC標記的20μg/ml Annexin-V 10μl和 50μg/ml PI 5μl，或 Annexin-V 及PI的同型對照抗體，避光反應15 min。采用尼龍膜過濾細胞，除去細胞團塊后，立即利用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測。

1.3.7 細胞轉移及侵襲實驗 ①細胞轉移實驗：采用Transwell實驗檢測轉染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細胞轉移能力。Transwell小室內加入100μl密度為1×105個/ml的無血清腫瘤細胞懸液，下室加入500μl含10%胎牛血清的1640培養基。24 h后甲醇固定，結晶紫染色，切下Transwell膜，封片。②細胞侵襲實驗：采用Transwell實驗檢測轉染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細胞侵襲能力。Transwell小室預先鋪基質膠，其余步驟同細胞轉移實驗。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析或t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZNF267在人TCC組織及細胞系中的表達

2.1.1 TCC組織 14例TCC組織中ZNF267 mRNA的相對表達量為（3.743±1.513），14例癌旁組織為（1.107±0.539），經t檢驗，差異有統計學意義（t=2.947，P=0.036），TCC組織中ZNF267 mRNA的表達水平高于癌旁組織。見圖1。

2.1.2 細胞系 ZNF267 mRNA在人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1中的相對表達水平為（1.000±0.050），在人TCC細胞系T24和BIU-87細胞中分別為（2.327±0.044）和（3.146±0.036），經方差分析，差異有統計學意義（F=3.895，P=0.027）。人TCC細胞系中ZNF267的表達水平高于人膀胱上皮永生化細胞。見圖2。

2.2 ZNF267 siRNA在TCC細胞中的沉默效率

2.2.1 T24細胞 人膀胱癌細胞系T24中ZNF267-NC組的ZNF267 mRNA相對表達水平為（1.000±0.05），ZNF267 siRNA 組為（0.384±0.061），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.176，P=0.032），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖3A。

2.2.2 BIU87細胞 人膀胱癌細胞系BIU87中ZNF267-NC組的ZNF267 mRNA相對表達水平為（1.000±0.05），ZNF267 siRNA 組為（0.417±0.031），經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.175，P=0.038），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖3B。

圖1 ZNF267在人TCC組織中的表達

2.3 ZNF267對TCC細胞增殖的影響

2.3.1 T24細胞 轉染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA后第3天起，T24細胞中ZNF267 siRNA組的OD值為（0.517±0.061），ZNF267-NC組為（0.982±0.067），經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.518，P=0.031），ZNF267 siRNA組低于ZNF267-NC組。見圖4A。

2.3.2 BIU87細胞 轉染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA后3天起，BIU87細胞中ZNF267 siRNA組的OD值為（0.841±0.053），ZNF267-NC 組為（1.176±0.071），經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.107，P=0.036），ZNF267 siRNA組低于ZNF267-NC組。見圖4B。

2.4 ZNF267對TCC細胞凋亡的影響

2.4.1 T24細胞 ZNF267-NC組的T24細胞凋亡 率 為（1.713±0.232）%，ZNF267 siRNA組 為（8.153±2.348）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.416，P=0.021），ZNF267-NC組低于ZNF267 siRNA組。見圖5A。

2.4.2 BIU87細胞 ZNF267-NC組的BIU87細胞凋亡率為（0.913±0.481）%，ZNF267 siRNA組為（11.329±3.591）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.461，P=0.016），ZNF267-NC組低于ZNF267 siRNA組。見圖5B。

2.5 ZNF267對TCC細胞周期的影響

圖2 ZNF267在人TCC細胞系中的表達

圖3 ZNF267 siRNA在TCC細胞中的沉默效率

圖4 ZNF267對TCC細胞增殖的影響

2.5.1 T24細胞 轉染ZNF267-NC的T24細胞G1期細胞百分比為（41.164±3.247）%，轉染ZNF267 siRNA為（56.838±3.546）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.147，P=0.027），ZNF267 siRNA組細胞周期與ZNF267-NC組比較，阻滯于G1期，細胞增殖受抑制。見圖6A。

2.5.2 BIU87細胞 轉染ZNF267-NC的BIU-87細胞G1期細胞百分比為（47.363±3.254）%，轉染ZNF267 siRNA為（62.663±2.581）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.149，P=0.031），ZNF267 siRNA組細胞周期與ZNF267-NC組比較，阻滯于G1期，細胞增殖受抑制。見圖6B。

2.6 ZNF267對TCC細胞轉移能力的影響

2.6.1 T24細胞 ZNF267-NC組的T24細胞轉移細胞增加（1.000±0.032） 倍，ZNF267 siRNA組為（0.353±0.083）倍，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.775，P=0.034），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖7A。

2.6.2 BIU87細胞 ZNF267-NC組的BIU87細胞轉移細胞增加（1.000±0.028）倍，ZNF267 siRNA組為（0.215±0.035）倍，經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.648，P=0.018），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖7B、C。

2.7 ZNF267對TCC細胞侵襲能力的影響

圖5 ZNF267對TCC細胞凋亡的影響

圖6 ZNF267對TCC細胞周期的影響

圖7 ZNF267對TCC細胞轉移的影響

2.7.1 T24細胞 ZNF267-NC組的T24細胞侵襲細胞增加（1.000±0.044） 倍，ZNF267 siRNA組為（0.321±0.931）倍，經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.106，P=0.011），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖8A。

2.7.2 BIU87細胞 ZNF267-NC組的BIU87細胞侵襲細胞增加（1.000±0.048）倍，ZNF267 siRNA組為（0.258±0.125）倍，經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.451，P=0.008），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖8B、C。

圖8 ZNF267對TCC細胞侵襲的影響

3 討論

ZNF267 Kruppel樣鋅指家族成員，其結構包括一個氨基酸末端的高度保守的Kruppel相關盒結構域，并通過連接區與鋅指結構區分隔[7]。研究發現，一氧化氮NO治療后，靜脈內皮細胞中ZNF267 mRNA表達水平上調[8]。此外，在肝星狀細胞活化過程及肝硬化組織中ZNF267的表達同樣上調[5]。更為重要的是，研究證實ZNF267在肝細胞癌中表達上調，并可促進腫瘤細胞的增殖與轉移[6]。然而，尚無研究闡明ZNF267在TCC中的表達及功能。本課題研究發現，ZNF267在TCC組織中的表達高于癌旁組織。細胞學實驗結果顯示，ZNF267在TCC細胞系中的表達亦高于永生化膀胱上皮細胞。利用RNA干涉技術沉默TCC細胞中ZNF267的表達后，TCC細胞增殖受抑制，而凋亡能力增強。研究還發現，沉默ZNF267在TCC中表達后，細胞周期被阻滯于G1期；細胞轉移和侵襲能力也受到抑制。本研究首次闡明ZNF267在TCC組織及細胞中的表達及其對TCC細胞功能的影響。

既往研究顯示，轉錄因子Ets-1為ZNF267的關鍵調控分子，可誘導ZNF267表達上調[6]。Ets-1可通過活化基質金屬蛋白酶和尿激酶型溶酶原活化物等多種酶的轉錄，在多種腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移中發揮重要作用[9-11]。研究發現Ets-1在TCC組織中的表達高于癌旁組織，且特異性干涉Ets-1表達后，TCC的惡性表型受抑制。Ets-1在TCC的發生、發展中發揮促癌分子作用[12]。TCC中高表達的Ets-1轉錄因子可誘導ZNF267的表達上調，從而使ZNF267發揮促癌分子作用。ZNF267表達水平的另一調控機制為HIF-1α通過調控Ets-1而間接調控ZNF267的表達。研究顯示，抑制Ets-1在肝細胞活性的重要調控分子缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）[13]，則ZNF267在肝細胞癌中的表達亦降低。缺氧可提高肝細胞癌中HIF-1α的表達[14]，并促進ZNF267的表達。在膀胱癌中，HIF-1α亞基與膀胱癌的分期、分級及轉移潛能密切相關[15]。HIF-1α及葡萄糖轉運蛋白1為膀胱癌預后的獨立預測指標[16-17]。根據本研究結果，HIF-1α可能亦通過間接上調ZNF267的表達，而促進膀胱癌的發生、發展。ZNF267參與Ets-1和HIF-1α調控TCC發生、發展的分子機制仍需進一步研究。

本研究發現，ZNF267在膀胱癌組織及細胞中表達上調，沉默其表達后，細胞增殖、轉移及侵襲受抑制，細胞凋亡增強，細胞周期被阻滯于G1期。本研究為闡明ZNF267在TCC發生、發展中的機制奠定了基礎，為膀胱癌的治療提供潛在可利用的分子靶點。

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