布魯氏菌外膜蛋白Omp16的原核表達、純化及多克隆抗體制備*

熊流新 ，黃 健 ，2，張 濤 ，李曉婷 ，徐 梅 ，陳昱希 ，陳安林 ，2，胡永林 ，2，閔 迅 ，2△（.遵義醫學院檢驗醫學院，貴州遵義563099；2.遵義醫學院附屬醫院醫學檢驗科，貴州遵義563003）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患疾病。該病在臨床上以長期發熱、多汗、關節損害、淋巴和肝、脾大為主要癥狀，其病程進入慢性期則可能導致多器官不可逆損害[1]。據WHO統計，全球每年有超過50萬新發病例[2]。近年來，該病發病例數及流行范圍不斷擴大，為世界公認危害公共衛生安全最大的傳染病之一[3]。臨床上主要以多西環素聯合利福平或鏈霉素治療為主[4]。近年來，對利福平耐藥布魯氏菌的相關報道正逐年增多，這給該病積極、有效的治療帶來嚴峻挑戰[5]。因此，布魯氏菌疫苗的相關研究正成為一種積極、有效的預防手段。

目前，布魯氏菌活疫苗主要分為2類，一類是減毒光滑型疫苗，主要包括羊種布魯氏菌Rev.1疫苗株、牛種布魯氏菌S19疫苗株、豬種布魯氏菌S2疫苗株，其含有的脂多糖（LPS）成分能刺激免疫細胞產生良好的保護作用[6]。但該類疫苗往往由于LPS O-側鏈能刺激產生非特異性抗體，導致臨床無法鑒別免疫接種與野生株感染。此外，其還存在較嚴重的毒力返祖現象，以致動物流產及播散性感染等情況的發生[7]。另一類是減毒粗糙型疫苗，主要包括牛種布魯氏菌R型45/20和RB51。其通過反復傳代減毒獲得，由于該疫苗本身不含LPS O-側鏈，所以不會干擾常規血清學檢查[8]。但其也存在免疫保護效果差，疫苗菌株不穩定從而出現粗糙型菌株轉變為光滑型菌株，并恢復強毒性等現象[9]。因此，研發免疫原性強、安全性好、價格低廉的布魯氏菌蛋白質疫苗正成為當前的研究熱點。

蛋白質疫苗具有免疫原性高、保守性好、能覆蓋絕大多數血清型及生產成本低廉等諸多優點[10]。TABYNOV等[11]研究證實，將布魯氏菌外膜蛋白Omp19制成的蛋白質疫苗誘導小鼠刺激CD4+T和CD8+T細胞產生干擾素γ（INF-γ），并且攻毒保護力能夠達到牛布魯氏菌S19疫苗株的水平。KIM等[12]研究BCSP31（布魯氏菌31 000的外膜蛋白）、Omp3b和Cu-Zn SOD（銅-鋅超氧化物歧化酶）作為蛋白質疫苗能引起強烈的Th1型免疫反應，顯著提高IFN-γ及腫瘤壞死因子α（TNF-α）分泌水平，激活巨噬細胞參與的細胞免疫。這些蛋白質在所構建的動物模型中均具有不同程度的保護效應。Omp16是布魯氏菌重要的毒力因子。研究證實，布魯氏菌在敲除Omp16后，影響了外膜肽聚糖的連接，致使布魯氏菌外膜結構受到破壞，最終細胞外膜通透性增加而導致細胞溶解死亡，這表明了Omp16是布魯氏菌存活必不可少的外膜蛋白[13]。文獻報道Omp16在進入小鼠體內時激活Toll樣受體4（TLR4），引起TLR4自身二聚化與髓樣細胞分化蛋白MyD88結合，MyD88與白細胞介素-1（IL-1）相關激酶（IRAK）結合導致IRAK自身磷酸化，激活腫瘤相關因子6（TRAF-6），使有絲分裂酶原蛋白激酶（MAPK）活化，一方面刺激依賴MAPK途徑的巨噬細胞，增強其吞噬活性，使TNF-α等細胞因子上調，另一方面通過核轉錄因子-κB（NF-κB）激活 I-κB 家族的α、β激酶，導致I-κB磷酸化降解，最后NF-κB轉到細胞核啟動 IL-1、IL-6、TNF-α 轉錄[14]。外膜蛋白Omp16在TLR4-MyD88信息轉導通路上突出的功能使其有望成為布魯氏菌蛋白疫苗研發的一個重要靶點。

迄今為止，尚鮮見布魯氏菌外膜蛋白Omp16重組蛋白疫苗保護效應的相關研究。因此，本課題擬通過生物信息學分析、基因克隆、蛋白質表達及純化技術，以及多克隆抗體制備等，以期為后續的Omp16蛋白質疫苗的研發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 大腸桿菌E.coliBL21（DE3）、pET28a（+）質粒、E.coliDH5a 為本課題組保存；布魯氏菌標準菌株（Brucella melitensis ATCC 23456）為遵義醫學院附屬醫院醫學檢驗科惠贈。

1.1.2 實驗動物 BALB/c小鼠，SPF級，7周，雌性，購自中國人民解放軍第三軍醫大學動物實驗室中心。所有動物的處理按照遵義醫學院倫理委員會行為準則進行。

1.1.3 主要試劑 營養瓊脂粉、丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、咪唑、雙丙烯酰胺、Tris堿、酵母提取物、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、胰蛋白胨、溴酚藍購于生工生物工程（上海）股份有限公司；甘氨酸、β-巰基乙醇、過硫酸銨、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、1.0 mol/L Tris-HCl（pH6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）、GoldView核酸染料、50×TAE Buffer、5%胎牛血清、HRP-羊抗鼠IgG 0.01 mol/L、磷酸鹽緩沖液（PBS）粉劑 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）底物顯色液、超敏電化學發光試劑盒、脫脂奶粉、PVDF膜、脫脂奶粉購于北京索萊寶公司；彩虹蛋白質Marker、DNA聚合酶（Primer Star高保真）、T4DNA連接酶、DNA Marker（DL2000、DL5000）、限制性內切酶 BamH Ⅰ/XhoⅠ購于日本TAKARA公司；基因組DNA抽提試劑盒、小量質粒DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒購于北京天根公司；血平板培養基購于鄭州安圖綠科生物工程有限公司；96孔ELISA板購于美國康寧公司；鋁佐劑（Inject Alum NO.77161）購于美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 Omp16蛋白生物學信息分析 利用隱馬爾科夫模型和神經網絡方法進行目的蛋白序列保守性預測（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）、跨膜結構預測（http：//www.cbs.dtu.dk/）、信號肽預測（http：//www.cbs.dtu.dk/）。1.2.2 引物設計 根據GenBank中布魯氏菌的基因序列（NC_009505.1），使用 PrimerPremier 5.0設計 2種不同序列的Omp16基因引物。Omp-16-1F：CGCGGATCCATGCGCCGTATCCAGTCGATTG，Omp-16-1R：CCGCTCGAGTTACCGTCCGGCCCCGTTGA，Omp-16-2F：CGCGGATCCATGAAGAAGAACCTTCCG，Omp-16-2R：CCGCTCGAGCCGTCCGGCCCCGTTGA，標有下劃線為限制性內切酶的酶切位點。本實驗引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增目的基因 以細菌DNA為模板，擴增條件如下。Omp16-1：98℃變性 20 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 45 s，30個循環，72℃延伸 5 min。Omp16-2：98℃ 變性 20 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 42 s，30個循環，72℃延伸5 min；4℃保存。取10μL進行1%瓊脂糖電泳，PCR產物經DNA回收試劑盒回收，-20℃保存。

1.2.4 構建2種不同序列布魯氏菌Omp16的重組質粒 用限制性內切酶BamHⅠ和XholⅠ同時雙酶切目的基因和質粒，使用DNA純化試劑盒回收。將目的基因和質粒按比例混合，使用T4連接酶在PCR儀中16℃連接16 h，連接產物轉入感受態細胞DH5a中，用含卡那霉素（100μg/mL）的LK平板篩選陽性克隆菌，使用質粒提取試劑盒提取質粒后，行雙酶切鑒定及送生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.2.5 蛋白誘導表達及純化 將重組質粒轉入E.coliBL21（DE3）中，在含有卡那霉素（100 μg/mL）的 LK 平板上，37℃培養過夜，挑取克隆陽性菌落轉于10 mL含有卡那霉素（1∶1 000）的 LB 培養液中，37℃，200 r/min搖菌過夜。次日按1∶50轉種含有卡那霉素（1∶1 000）的LB培養液中，將菌液搖至600 nm波長下光密度（OD）600nm值為 0.5時加入IPTG 1 mmol/L，28℃、160 r/min誘導過夜后收菌。將其用1×Binding Buffer重懸后在冰上超聲破菌，將破菌后的上清液轉入鎳柱親和層析柱（Ni-NTA）中，經咪唑緩沖液（20、30、40 mmol/L 咪唑，pH8.5，10 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl）充分洗脫后，用洗脫液（500 mmol/L 咪唑，pH8.5，10 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl）洗脫目的蛋白。行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測蛋白的純度，用PBS超濾除去咪唑和NaCl，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.6 多克隆抗體制備及其效價的檢測 將7周齡雌性BALB/c小鼠24只，按照隨機分配原則設立實驗組和空白對照組。每組免疫6只小鼠，空白對照組僅注射佐劑，實驗組注射佐劑與重組蛋白按1∶1混合的蛋白懸液。免疫劑量10μg/只（首次劑量加倍），免疫途徑為經皮下多點注射，每次間隔2周，共免疫3次。末次免疫后第7天，經尾靜脈采集血液，分離血清放4℃冰箱備用。采用間接ELISA法檢測血清抗體效價：抗原包被，將目的蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋至100μg/mL，將稀釋后的樣品加到96孔板中，每孔100μL，4℃過夜。每孔加入牛血清白蛋白（BSA）5%封閉2 h。用空白對照組小鼠血清作陰性對照。干燥清潔條件下將BALB/c小鼠斷尾采血清，將1μL小鼠血清加進封閉液100μL，按比例稀釋至1×109，37℃孵育1 h。用專門PBS洗滌液洗板并吸干水。每孔加入100μL HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋）37℃孵育1 h。洗板吸干水后加入100μL TMB顯色終止液顯色30 min，上酶標儀前加入100μL顯色終止液。將酶標儀波長設置為450 nm，檢測OD值。以待測標本OD450nm（P）/Alum 佐劑（N）≥2.1 結果判斷為陽性結果。

1.2.7 Western blotting檢測Omp16蛋白的表達 取20μL2種不同序列的布魯氏菌Omp16蛋白，分別加入5μL的5×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10 min，10 000 r/min、5 min后取5μL進行SDS-PAGE電泳。電泳后轉PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用小鼠血清（1∶1 000）作為一抗4℃孵育16 h；PBST洗滌3次，加入HRP羊抗鼠 IgG（1∶5 000）作為二抗，37℃孵育 1 h，PBST 洗滌3次后使用超敏電化學發光試劑盒檢測結果。

2 結 果

2.1 Omp16蛋白保守結構域預測 Omp16蛋白分子保守性較高，在61-163aa處含有1個保守結構域，命名為OmpA-C-like超家族，見圖1。

圖1 Omp16蛋白的保守性預測結果

2.2 Omp16蛋白跨膜結構預測 Omp16蛋白在氨基端6-28aa處可能有1個跨膜結構，見圖2。

圖2 Omp16蛋白跨膜結構預測結果

2.3 Omp16蛋白信號肽預測 Omp16蛋白在氨基端1-24 aa處有 1個信號肽（Y=0.570），見圖3。

圖3 Omp16蛋白信號肽預測結果

2.4 Omp16基因的擴增 根據以上生物信息學分析，本研究擬擴增全長及截短的Omp16基因序列Omp16-1（1-504）、Omp16-2（82-504），擴增產物經瓊脂糖電泳分析顯示，分別于504、423 bp處可見清晰的特異性條帶，大小與預期相符（圖4A），將 pET28a（+）-Omp16-1、pET28a（+）-Omp16-2重組質粒雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳，可見酶切產物與目的基因大小相符的酶切片段（圖4B）。構建的質粒經生工生物工程（上海）股份有限公司分析，結果與預期一致，提示重組質粒構建成功（圖5）。

圖4 全長及截短表達的Omp16基因PCR擴增與重組質粒雙酶切鑒定

圖5 重組質粒測序峰圖

2.5 重組蛋白的誘導表達及純化 全長及截短表達的Omp16經 IPTG誘導后，在相對分子質量19.2×103、16.5×103處可見特異性蛋白條帶，大小與預期相符（圖6），經Ni-NTA純化后可獲得高純度的目的蛋白。

2.6 多克隆抗體的制備和抗體效價檢測 將全長及截短表達的Omp16重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，采用間接ELISA法檢測血清IgG效價。實驗結果顯示佐劑對照組幾乎不產生Omp16抗體，實驗組全長及截短表達的Omp16重組蛋白的血清IgG效價高達1×107，提示Omp16重組蛋白能刺激小鼠產生較強的免疫應答（圖7），Omp16-1、Omp16-2均能刺激小鼠產生高滴度的多克隆抗體（均P＜0.05），且2組間抗體滴度比較無顯著變化（均P＞0.05）。

圖6 全長及截短表達的Omp16重組蛋白純化的SDS-PAGE圖

圖7 小鼠皮下免疫后血清IgG抗體效價檢測

2.7 重組蛋白Western blotting鑒定 將純化的全長及截短表達的布魯氏菌Omp16重組蛋白作為抗原，小鼠抗血清作為一抗，通過Western blotting進行鑒定（圖8）。結果提示2種Omp16重組蛋白均能與小鼠血清中的抗體特異性結合。

圖8 重組蛋白Omp16的Western blotting鑒定

3 討 論

蛋白質疫苗具有免疫效果好且安全性高的特點，新的保護性抗原的篩選對提高其免疫保護效果具有十分重要的意義。MALLICK等[15]研究發現，布魯氏菌核糖體蛋白L7/L12在未經脂化處理時無法引起免疫保護反應，但經過脂化處理后能引起強烈的體液免疫和細胞免疫反應，產生高滴度的IgG2a，攻毒保護效果明顯增加。Omp16是布魯氏菌重要的毒力因子，屬于脂蛋白[16]。Omp16在TLR4-MyD88信息轉導通路上突出的功能，使其有望成為布魯氏菌蛋白疫苗的一個重要抗原靶點。

本課題采用的原核表達是最常用的表達系統，是應用最早、最廣泛的系統，簡便快捷、成本低廉。但原核表達系統存在2個關鍵的問題：（1）異源表達的蛋白與大腸埃希菌系統不相容，蛋白無法表達；（2）表達的蛋白不可溶。影響因素包括蛋白自身的因素、載體選擇、誘導劑的量、誘導時間、誘導溫度等[17]。本課題組先后嘗試了不同的載體，如pE-SUMO載體、pCold I載體等，但其表達產物均為包涵體形式。實驗最終選用pET28a（+）載體，pET系統是目前E.coli克隆表達重組蛋白最強大的系統，當目的基因克隆到質粒時，受噬菌體T7強轉錄和可選擇的翻譯信號控制，T7 RNA酶十分高效，短時間內可使目的蛋白產量達到細菌總蛋白50%以上。本實驗選用大腸埃希菌表達系統E.coliBL21（DE3），因其遺傳背景清楚，能高效表達具有生物學活性的蛋白分子[18]，在實驗過程中發現，Omp16-1蛋白可溶性的表達量較低，且主要以包涵體形式出現，為了獲得重組蛋白Omp16的大量可溶性表達，本研究對Omp16蛋白全長進行生物學信息分析，發現這可能與其在N端1-24 aa處有1個信號肽（Y=0.570），且N端6-28 aa的位置存在1個跨膜結構密切相關。本研究通過生物學信息綜合分析，成功構建了 pET28a（+）-Omp16-2 的截短表達質粒，轉入E.coliBL21（DE3），經IPTG誘導后獲得了大量高純度、可溶性的目的蛋白Omp16-2，也從側面證實了上述預測的正確性。

本研究采用全長及截短表達的重組蛋白Omp16，通過皮下多點注射的方法免疫BALB/c小鼠，結果證實Omp16-1、Omp16-2均能刺激小鼠產生高滴度的多克隆抗體（均P＜0.05），且2組間抗體滴度比較無顯著變化（均P＞0.05）。Western blotting實驗證實 2種 Omp16重組蛋白均能與小鼠血清中的抗體特異性結合。因此，推測Omp16的抗原表位可能位于OmpA-C-like超家族結構域。后續研究將依托制備的高純度、高含量的重組蛋白Omp16-2，擬通過構建布魯氏菌的黏膜或食道感染模型，通過系列主動免疫、被動保護等體內外實驗，進一步驗證重組蛋白Omp16在布魯氏菌感染方面的保護效應。

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