橙皮素標準樣品的研制

宋祥云，劉金宇，耿巖玲，林云良，付瑞明，崔莉，王岱杰*

(1. 山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006)

橙皮素(5, 7, 3′-三羥基-4′-甲氧基-黃烷酮)是一種重要的黃酮類化合物，具有獨特的藥理活性，廣泛應用于醫學的各個領域[1]。橙皮素具有健胃、祛痰、鎮咳、驅風、利尿、抗病毒、止逆和止胃痛等功效?，F代藥理研究表明，橙皮素還具有抗氧化[2-4]、擴張血管、降血脂[5]、抗癌[6-9]、抗炎[10]、改善血腦屏障[11-12]等多種藥理活性。

圖1 橙皮素化學結構式Fig. 1 The chemical structure of hesperetin

橙皮素作為一種重要的藥物原料，在自然界中分布廣泛，同時也是多種植物產品的重要質量控制指標。目前市場上橙皮素以對照品為主，純度參差不齊，未按照國家標準進行均勻性、穩定性和定值實驗，最終結果沒有不確定度評價，樣品也不具有溯源性。因此，為了滿足橙皮素及相關產品的檢測需求，保證檢測結果的準確性、可比性和溯源性，本文按照GB /T 15000. 3—2008標準樣品工作導則[13]，成功研制出了橙皮素國家標準樣品(圖1)。

1 實驗部分

1.1 儀器

R-3型旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；SCIENTZ-10N型冷凍干燥儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)； LC-6A型制備液相色譜儀(日本島津公司)；WRS-1B型數字熔點儀(上海精密科學儀器有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；INOVA 600 MHz核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司)；6520 Q-ToF型液質聯用儀(美國安捷倫公司)；STA 449FC同步熱分析儀(德國耐馳公司)。

1.2 試劑與原料

柱層析硅膠、GF254薄層硅膠板(青島海洋化工廠)；高效液相色譜用甲醇為色譜純(美國天地公司)，水為重蒸水，其他試劑為分析純；橙皮素對照品(成都德思特生物技術有限公司)。

陳皮藥材購自濟南建聯中藥店，經山東省中醫藥大學李佳教授鑒定為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥成熟果皮，樣本存放于山東省分析測試中心。

1.3 樣品制備

1.3.1 橙皮素粗提物的提取

陳皮藥材粉碎至40目，95%乙醇加熱回流藥材3次，每次3 h，抽濾，減壓濃縮至無醇味，加水分散，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚和乙酸乙酯浸膏，乙酸乙酯浸膏冰箱保存備用。

1.3.2 橙皮素的富集

將乙酸乙酯浸膏進行硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑體系梯度洗脫，分瓶收集，薄層色譜和HPLC監測，橙皮素對照品比對，收集橙皮素含量較高的組分，減壓濃縮。

1.3.3 制備液相色譜分離

圖2 橙皮素單體的制備液相色譜圖Fig. 2 Chromatogram of hesperetin purified by prep arative HPLC

1.4 純度分析方法

1.4.1 高效液相色譜分析

1.4.2 薄層鑒別

1.4.3 熱重分析

精密稱取樣品5 mg，置于熱重用坩堝中，熱重條件：初溫 30 ℃，最終溫度 600 ℃，升溫速率10 ℃/min，氣體N2，流量100 mL/min。

1.5 結構表征

橙皮素單體的結構表征采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜(MS)和核磁共振(NMR)等技術。UV 法的測試溶劑為甲醇，掃描范圍為200～400 nm；IR法采用KBr壓片，掃描波數為400～4 000 cm-1；MS為電噴霧離子源，載氣溫度為300 ℃，載氣流速為10 L/min，普氮為載氣，毛細管電壓為4.0 kV，掃描范圍m/z為100～1000；NMR法 的氘代試劑為CDCl3。

1.6 均勻性檢驗

1.7 穩定性檢驗

橙皮素樣品儲存溫度為0～4 ℃，考察樣品的1年穩定期，分5個時間段監測，按1.4.1中規定方法進行分析，樣品純度讀取采用峰面積歸一化法，每份樣品測定6次，統計分析采用t檢驗法[13]。

1.8 定值

根據工作導則，標準樣品的定值采用8 家實驗室協作進行的方法。隨機抽取樣品24瓶，每家定值實驗室寄出樣品3瓶，每瓶測定2次，協作實驗室共出6個檢測結果，按1.4.1中規定方法進行分析，樣品純度以峰面積歸一化法讀取[13-14]。

2 結果與討論

2.1 純度分析

圖3 橙皮素等度洗脫HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of hesperetin by isocratic elution

2.2 結構表征

2.3 均勻性檢驗

將結果進行F檢驗，進行數據統計，確定橙皮素樣品的均勻性，結果見表1和表2。

表1 均勻性檢驗數據Table 1 Results of homogeneity test

表2 方差分析數據Table 2 Results of variance analysis

瓶間方差的計算公式：

則瓶間標準偏差為：

u均=sbb=0.03%，

其中，u均為均勻性檢驗不確定度。

F值的計算公式：

F=MS瓶間/MS瓶內=2.16。

以組間自由度υ1=9和組內自由度υ2=20為變量查F臨界值表，可知F0.05(9，20)=2.39，由于F值小于F臨界值，因此所研制的橙皮素標準樣品具有良好的均勻性。

2.4 穩定性檢驗

采用t檢驗對穩定性結果進行統計分析，采用直線模型，觀察斜率值變化情況，并進行預測，結果見表3。

表3 穩定性檢驗數據Table 3 Results of stability test of

斜率計算公式如下：

截距計算公式如下：

直線模型的標準偏差：

則s=0.20%。

斜率相關不確定度計算公式如下：

查表得自由度為n-2和95%置信水平(p=0.95)分布的t因子為3.182。

由于斜率變化的絕對值|b1|

因此，斜率變化不顯著，即橙皮素標準樣品在1年內穩定性良好。

穩定性檢驗的不確定度為：

u穩=Sb×t=0.11%。

其中，u穩為穩定性檢驗不確定度。

2.5 定值

根據各個協作實驗室的反饋結果，進行數據的統計分析，并最終確定橙皮素標準樣品的標準值和不確定度統計結果見表4。

表4 協作定值數據Table 4 Results of cooperative certification

測定結果總平均值的計算公式如下：

實驗室平均值的標準偏差為：

總平均值標準偏差為：

則多家實驗室聯合定值引入的不確定度為：

其中，u定為定值不確定度。

橙皮素標準樣品的不確定度有如下三部分組分：(1)均勻性檢驗不確定度；(2)穩定性檢驗不確定度；(3)定值不確定度，這三部分不確定度分量互不相關，需將三種不確定度合成，即合成不確定度(U合成)為：

U合成2= u均2+ u穩2+ u定2。

代入數據計算得U合成=0.13%。

置信區間95%時，k=2。

則橙皮素標準樣品的擴展不確定度：

U擴展=2U合成=0.13%×2=0.26%。

3 結論

本研究針對橙皮素及相關產品缺乏國家標準樣品的現狀，嚴格按照國標規定的標樣樣品研制規則，成功地研制出橙皮素標準樣品，并順利通過了專家驗收。研制過程中對標準樣品的均勻性進行考察，并進行方差分析；穩定性檢驗采用直線模型，并進行了t檢驗法考察；定值采用多家實驗室協作，對定值結果進行統計分析。根據三個方面引入的不確定度，進行了不確定度的合成和擴展，獲得了標準值為98.78%，置信度95%的不確定度為0.26%的橙皮素國家標準樣品，具有樣品溯源性，可用于相關產品的檢測方法評定和含量測定，填補了橙皮素標準樣品的國內外空白。

[1]FORMICA J V, REGELSON W. Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids [J]. Food Chem Toxicol, 1995, 33(12): 1061-1080.

[2]CHO J. Antioxidant and neuroprotective effects of hesperidin and its aglycone hesperetin [J]. Arch Pharm Res, 2006, 29(8): 699-706.

[3]CAI Y Z, LUO Q, SUN M, et al. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer [J]. Life Sci, 2004, 74(17): 2157-2184.

[4]HEIM K E, TAGLIAFERRO A R, BOBILYA D J. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships [J]. J Nutr Biochem, 2002, 13(10): 572-584.

[6]ARANGANATHAN S, PANNEER SELVAM J , NALINI N. Hesperetin exerts dose dependent chemopreventive effect against 1, 2-dimethyl hydrazine induced rat colon carcinogenesis [J]. Invest New Drugs, 2009, 27(3): 203-213.

[7]ARANGANATHAN S, SELVAM J P, SANGEETHA N, et al. Modulatory efficacy of hesperetin (citrus flavanone) on xenobiotic-metabolizing enzymes during 1, 2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis [J]. Chem Biol Interact, 2009, 180(2): 254-261.

[8]COORAY H C, JANVILISRI T,von VEEN H W, et al. Interaction of the breast cancer resistance protein with plant polyphenols [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 317(1): 269-275.

[9]SO F V, GUTHRIE N, CHAMBERS A F, et al. Inhibition of proliferation of estrogen receptor-positive MCF-7 human breast cancer cells by flavonoids in the presence and absence of excess estrogen [J]. Cancer let, 1997, 112(2): 127-133.

[11]MITSUNAGA Y, TAKANAGA H, MATSUO H, et al. Effect of bioflavonoids on vincristine transport across blood-brain barrier [J]. Eur J Pharmacol, 2000, 395(3): 193-201

[12]YOUDIM K A, DOBBIE M S, KUHNLE G, et al. Rice-Evans, Interaction between flavonoids and the blood-brain barrier: in vitro study [J]. J Neurochem, 2003, 85(1): 180-192.

[13]中國國家質量監督檢驗總局, 中國國家標準化管理委員會. GB/T 15000.3—2008/ISO Guide 35:2006, 標準樣品工作導則(3)標準樣品定值的一般原則和統計方法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[14]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GB/T 8170—2008 數值修約與極限數值的表示和判定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[15]李曉強, 張培芬, 段文達, 等. 白花泡桐花的化學成分研究[J]. 中藥材, 2009，32(8): 1227-1229.

[16]何桂霞, 裴剛, 杜方麓, 等. 藤茶化學成分的研究[J]. 中國現代中藥, 2007, 9(12): 11-13.