高大鬼針草的形態與顯微鑒定

鄭曉文，邴帥，劉政，陳文華，譚會穎，徐凌川

(山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

鬼針草屬(BidensL.)植物隸屬于菊科(Compositae)管狀花亞科(Arduoideae Kitam.)向日葵族(Trib.Heliantheae Cass.)，為一年生的草本植物。鬼針草屬植物在全世界大致有230～240種，分布在熱帶以及溫帶地區，其中分布種類最豐富的地區是美洲[1-3]。該屬植物中國各地均有分布，在路邊和農田中常見，是民間常用草藥[4-6]。

2015—2017年，我們在青島、臨沂、濟南分別采到一種鬼針草屬植物，此植物特別高大，在葉形等方面與鬼針草屬其他種有明顯區別。結合相關文獻，本文對原植物在植物形態、顯微鑒別、分子鑒別等方面進行了研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

原植物經山東中醫藥大學生藥教研室徐凌川教授鑒定并定名為高大鬼針草(BidensproceraL.C.Xu ex X.W.Zheng)，憑證標本均保存于山東中醫藥大學藥學院標本室(SDCM)。

1.2 儀器

YXJ-2離心機(常州國華電器有限公司)；SW-CJ-1D潔凈工作臺(上海鼎科科學儀器有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科學儀器有限公司)；光學顯微鏡(德國Bresser公司)；IB-5型離子濺射儀(日本EIKO公司)；PCR反應擴增儀(天津金思德生物技術有限公司)；SUPRATM55 熱場掃描電子顯微鏡(德國蔡司公司) ；水合氯醛、濃鹽酸、間苯三酚等試劑均為分析純；娃哈哈純凈水

2 方法

2.1 形態鑒別

對植物的外觀形態進行觀察，對其形態特征進行描述。

2.2 顯微鑒別

制作莖的臨時切片時，采用徒手切片法切片，后加間苯三酚試液1～2滴，稍放置，再加濃鹽酸1滴染色，在顯微鏡下觀察。

制作葉下表皮的臨時裝片，采用葉表皮制片法做葉下表皮的水裝片，顯微鏡下觀察其顯微特征。

制作粉末的臨時裝片時，采用粉末制片法制作莖、花、葉的粉末透化片，觀察組織構造與粉末特征并繪圖[7]。

將高大鬼針草的花粉均勻放置在粘有雙面導電膠的掃描電鏡標本臺上，經IB-5型離子濺射儀噴金后，在熱場發射掃描電子顯微鏡下觀察花粉粒形態，并對花粉粒進行拍照。花粉粒形狀由極軸與赤道軸的比值決定，P/E的值在0.88～1.14之間為近球形，花粉粒大小由極軸與赤道軸(P×E)來決定[8]，刺狀突起的密度按100 μm2的刺狀突起個數表示。

2.3 分子鑒別

通過試劑盒法提取高大鬼針草的基因組DNA，經PCR反應程序，將PCR反應產物純化后，對核糖體DNA ITS區域的堿基序列進行測定，記錄高大鬼針草DNA的ITS堿基序列。

3 結果

3.1 原植物形態

一年生草本植物，高70～220 cm。莖直立，表面綠色，為四棱形，稍扁，有縱條紋，有稀疏短毛或無毛，四周向內凹陷，斷面深綠色，中間髓為白色。葉草質，葉脈為羽狀網脈，葉上表面有稀疏的白色短毛，葉下表面有密集的白色柔毛，較上表面長且多，葉柄長，背面微凸，正面有溝，溝內及邊緣有稀疏的白色柔毛，葉柄基部有白色柔毛，葉味苦、有清香；上部葉二回或一回羽狀分裂，互生或對生，中部葉最大，二至四回羽狀分裂，對生，頂生裂片為條狀披針形，無或具1～3個不規則粗齒，下部葉二至三回羽狀分裂，對生，頂生裂片為三角狀或菱狀披針形，邊緣有不規整的粗齒。頭狀花序單生莖端和枝端，連同總苞苞片直徑4～5 mm，高約4～7 mm。舌狀花黃色，有2～4枚；總苞鐘狀或杯形，外層苞片7～9枚，通常為8枚，倒卵狀披針形，葉狀，草質，被柔毛，邊緣有緣毛，內層苞片通常10枚，披針形，膜質，長6～7 mm，具淡黃色邊緣，無舌狀花，筒狀花兩性，黃色，花冠長約5 mm，冠檐5裂；瘦果條形，具四棱，黑褐色，長約0.6～1.5 cm、寬約0.4～0.8 mm(不包括芒刺)，兩端漸漸狹窄，表面有淡黃色短毛或者瘤狀突起，頂端芒刺4枚，長約0.1～0.2 cm，具倒刺毛，果基圓形，淡黃褐色，向背面傾斜。花期為6～9月，果期為6～11月。

3.2 顯微鑒別

3.2.1 莖橫切面

呈方形，四角有明顯棱脊。表皮細胞為一列細胞，沿切線延長。皮層窄，由5～7列薄壁細胞組成，排列較為疏松，有數列厚角組織。內皮層為一列細胞。韌皮部纖維束多呈半月形，斷續排列。維管束為無限外韌型，大小不等，16～24個環列，其中一組對邊維管束較另一組發達，韌皮部細胞狹窄，形成層成環，木質部斷續呈環狀排列，木質部導管2～6個并列徑向排列。髓部較寬廣，由薄壁細胞組成，約占莖部橫切面的2/3。見圖1。

1表皮；2皮層； 3厚角組織；4中柱鞘纖維； 5韌皮部；6形成層；7木質部； 8髓；9內皮層。圖1 高大鬼針草莖的橫切面圖Fig.1 Transverse section of stem of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.2 葉下表皮

葉表皮細胞形狀不規則，側壁呈波紋狀彎曲，互相鑲嵌。氣孔類型為不定式或不等式，副衛細胞約3～5個細胞。表皮細胞非腺毛多見，約4～12個細胞。見圖2。

圖2 高大鬼針草葉下表皮圖Fig.2 The lower epidermis of the leaf of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.3 粉末

黃綠色。纖維眾多。非腺毛為線狀毛，單細胞或2～15個細胞組成。導管多見螺紋，少見梯紋、環紋導管。葉碎片表皮細胞形狀不規則，側壁呈波紋狀彎曲、彼此互相鑲嵌、大小不等，氣孔類型為不定式或不等式。花粉粒圓球形，表面為刺狀紋飾。草酸鈣方晶少見。少見色素塊。見圖3。

1表皮細胞及氣孔； 2非腺毛； 3冠毛；4導管；5纖維；6花粉粒；7花粉囊內壁細胞。圖3 高大鬼針草粉末特征圖Fig.3 Characteristic chart of powder of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.2.3 花粉粒的觀察

花粉粒近球形，極軸25.61 μm(24.94～26.27 μm)，赤道軸20.73 μm(20.31～21.14 μm)，極赤比為1.24(1.21～1.26)；花粉粒大小是25.61 μm(24.94～26.27 μm)×20.73 μm(20.31～21.14 μm)；極面觀為三裂圓形，赤道觀為近圓形，萌發孔為三孔溝；外壁紋飾：刺狀突起、刺漸尖、刺長4.72 μm(4.58～4.86 μm)、刺密度4.20(4.05～4.53)，基部膨大、有少量閉孔，基部寬4.21 μm(4.09～4.34 μm)，座間有大量疣狀突起(括號外是各參數的均數，括號內是均數的95%置信區間)。見圖4。

圖4 高大鬼針草花粉粒的掃描電鏡圖Fig.4 SEM figure of Bidens procera L.C.Xu ex X.W.Zheng

3.3 DNA的ITS序列

本次實驗測得原植物DNA的ITS序列為：

GGGGTGTCTTGATCTTGGCCTAGCTGATCGACTCGTGTACATGTACTTACACCTGGCTTT

GCGAGGACCAAAGCTCTTGTTTTGAGCCTCGTAAAGCCTTGTTGGCCTGCATTTAGGGCC

GCCCCTCGGGGTGTCCTGGATGTAGGTCGACACAACTAACAATTCGGCACAACACGTGCC

AAGGAAAACATTACTTAAAGGGCCCGTGCCATGTCGCCCCGTTTACGGCAAGCGCGTTGC

ACGTGGCCTCTTTGTAACCCTAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCG

ATGAAGAACGTAGCAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGA

GTTTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCTGGCTGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTC

ACGCATCACGTCGCCCCCACCATCCATCCCTTCTCGGGACATGTTGGTGTGGGGCGGAGA

TTGGTCTCCTGTGCCATGGCACGGTTGACCTAAATAGAAGTCCCCTCATGAGTGACGCAC

GACTAGTGGTGGTTGATAAGACTGTCGTATCGTGTCGTGCGTTCGTTTCATGCGGGCTTG

ACTCCTTGTAAAACCCACATGTGTTGTCCTGTGACGATGCTTCGATCGCGACCCCAGGTC

AGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAAAAACCGGAGGAAA

將本次實驗結果在National Center for Biotechnology Information中的Gen Bank上經Blast后進行同源率分析，對比結果顯示，與原植物的同源率最高的植物是婆婆針，同源率為89%，經山東中醫藥大學生藥教研室徐凌川教授鑒定為鬼針草屬植物高大鬼針草(BidensproceraL.C.Xu ex X.W.Zheng)。

4 小結與討論

通過對原植物DNA的ITS堿基序列在NCBI中進行同源率分析鑒定后，結果顯示與高大鬼針草同源率最高的植物是婆婆針。其與中國鬼針草屬植物型態異同點見表1。

表1 中國鬼針草屬植物葉、瘦果以及芒刺等特征的異同點Table 1 The similarities and differences of characteristics in leaves、achenes and prickles of Bidens L. from China

通過對高大鬼針草莖以及葉的形態、性狀、顯微特征進行系統的研究，發現高大鬼針草形態的鑒別要點是全株高70～220 cm。莖直立，表面綠色，為四棱形，有縱條紋。葉草質，葉脈為羽狀網脈，葉柄長。頭狀花序，總苞鐘狀或杯形，舌狀花黃色，筒狀花兩性；瘦果條形，具四棱，黑褐色，頂端芒刺四枚，具倒刺。顯微特征的鑒別要點是：(1)莖橫切面特征：莖表皮細胞為一列細胞；皮層窄，韌皮部纖維束多呈半月形，維管束為無限外韌型，韌皮部細胞狹窄，形成層成環，木質部斷續呈環狀排列；髓部寬廣。(2)葉下表皮特征：葉表皮細胞形狀不規則，側壁呈波紋狀彎曲；氣孔類型為不定式或不等式；表皮細胞非腺毛多見。粉末特征：非腺毛為線狀毛；導管多見螺紋，少見梯紋、環紋導管；花粉粒圓球形，表面為刺狀紋飾，萌發孔為三孔溝。

本文的鑒定方法簡便、易操作，得到了高大鬼針草重要的生藥學鑒定特征，為高大鬼針草的生藥學鑒定以及進一步的深入研究與利用提供了可靠的依據。

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