生物傳感器在玉米酶法浸泡工藝中的應用

劉慶艾，馬恒，馬耀宏，楊俊慧，孟慶軍，楊艷，史建國

(齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

在淀粉及淀粉糖生產中多釆用濕磨工藝生產玉米淀粉[1]，其中浸泡是玉米淀粉濕法加工過程中的一個重要環節，玉米浸泡的質量直接影響后道工序的正常生產以及淀粉的產量和質量[2-3]。因此，對玉米浸泡過程中的參數進行控制具有重要意義。由于分析方法的不足，以往研究多局限于傳統控制參數，如溫度、pH值、浸泡時間、亞硫酸濃度等，對浸泡過程中重要生化參數的變化規律缺乏深入了解。其中乳酸、葡萄糖、還原糖是反映浸泡過程變化最重要的生化參數，不僅能直接反映出浸泡液中內溶物的溶出程度和微生物的代謝活動，而且乳酸的含量對浸泡效果也起到重要作用[4-5]。因此，對乳酸、葡萄糖、還原糖的適時檢測是浸泡條件優化及后續高品質淀粉生產的重要保障。

在傳統的檢測方法中，乳酸采用中和滴定法或比色法[6]，葡萄糖采用碘量法進行測定[7],還原糖則采用費林試劑法進行測定[8]，耗時、樣品消耗量大且穩定性不好。本文采用生物傳感器分析方法，對酶法玉米浸泡工藝過程的乳酸、葡萄糖、還原糖進行快速測定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米：含水量(質量分數)12.6%(菱花集團有限公司玉米淀粉生產車間)；酸性蛋白酶：酶活50 000 U/g以上(北京索萊寶科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

YP201N電子天平(上海菁海儀器有限公司)；303A2電熱恒溫培養箱(南通宏大實驗儀器有限公司)；DHG系列電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；西廚多功能粉碎機(鉑歐五金廠)；HHS恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠)；LXJ64-01離心機(河北省吳橋電機廠)；SBA-40D型生物傳感儀(山東省科學院生物研究所)；SGD- IV型全自動還原糖測定儀(山東省科學院生物研究所)。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米浸泡方法

準確稱取400 g玉米于浸泡罐中，加入1 000 mL 0.6%的乳酸溶液，50±2 ℃浸泡20 h；將玉米粗破碎，以1 000 U/g(玉米)的加酶量向浸泡液中加入酸性蛋白酶，50±2 ℃浸泡30 h。每隔2 h取樣。

1.3.2 傳統測試方法

1.3.2.1 滴定法[6]測定乳酸含量

取浸泡液50 mL，5 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL于100 mL三角瓶中，加蒸餾水50 mL，用1 mol/L NaOH調節發酵液pH大于12，鈣黃綠素指示劑0.02 g，用0.05 mol/L EDTA·Na2溶液滴定至背光由黃綠色轉變為橙色為止，并記錄消耗體積。

W=M*c*V/V0,

式中：W為乳酸含量，mg/L；V為滴定消耗EDTA·Na2的體積， L；V0為試樣體積，L；c為EDTA·Na2的濃度，mol/L；M為乳酸摩爾質量，mg/mol。

1.3.2.2 碘量法[7]測定葡萄糖含量

準確移取玉米浸泡液25.00 mL和碘標準溶液25.00 mL于碘量瓶中，慢慢滴加2 mol/L NaOH，將碘量瓶加塞搖勻，放置15 min使之完全反應。加入2 mL 6 mol/L HCl，立即用Na2S2O3標準溶液滴定至溶液呈淺黃色，加2 mL淀粉指示劑，繼續滴定至藍色消失即達到滴定終點，記錄數據，平行滴定3次。

W1=(c1V1-0.5c2V2)*M1/V3,

式中：W1為葡萄糖含量，mg/L；V3為浸泡液試樣的體積，L；V1為碘標準溶液的體積，L；c1為碘標準溶液的濃度，mol/L；V2為滴定消耗Na2S2O3的體積，L；c2為Na2S2O3的濃度，mol/L；M1為葡萄糖摩爾質量，mg/mol。

1.3.2.3 費林試劑法[8]測還原糖含量

移取浸泡液溶液50 mL于400 mL燒杯中，加入費林試劑甲、乙液各25 mL。加蓋表面皿，置電爐上加熱，并在4 min內沸騰，再煮沸2 min，趁熱用鋪有石棉的坩堝抽濾，并用60 ℃熱水洗滌燒杯和沉淀，至洗液不呈堿性為止。向坩堝中加入硫酸鐵溶液和水各25 mL，用玻璃棒攪拌，使氧化亞銅完全溶解，用前面使用過的燒杯收集溶液，以0.1 mol/L高錳酸鉀標準溶液滴定至微紅色。同時取水50 mL，加費林試劑甲、乙液各25 mL，做試劑空白組。

X= (V4-V5)*c3*M2/V4,

式中：X為氧化亞銅濃度，mg/L；V4為試樣消耗高錳酸鉀標準溶液的體積，L；V5為試樣空白消耗高錳酸鉀標準溶液的體積，L；V4為試樣體積，L；c3為高錳酸鉀標準溶液的摩爾濃度，mol/L；M2為氧化亞銅摩爾質量，mg/mol。

由所得氧化亞銅質量按GB/T 5513-2008[8]查出還原糖質量。

1.3.3 生物傳感器測試方法

利用生物傳感器測定浸泡液中乳酸、葡萄糖、還原糖的含量，測定時每次取樣量為25 μL,響應時間20 s，測定周期小于2 min,誤差小于2 %。樣品不需脫色、分離純化就可直接測定[9]。

2 結果與討論

玉米酶法浸泡過程表現出復雜的物理、化學和生物學變化，其中葡萄糖、還原糖的溶出與乳酸菌的產生有關[10]，而乳酸菌的生長又與乳酸的產生和葡萄糖、還原糖的消耗密切相關。

2.1 生物傳感器測試浸泡過程中葡萄糖的變化規律

2.2.1 葡萄糖含量的變化

如圖1所示，在開始乳酸浸泡的20 h內，浸泡液中葡萄糖的含量持續上升；酸性蛋白酶作用階段，20～40 h這段時間內，浸泡液中的葡萄糖含量開始下降，而在40 h后又有一定程度的反彈上升。這可能是因為，在浸泡初始階段，乳酸菌的生長不夠旺盛，處于遲緩期，對葡萄糖的消耗的速率低于葡萄糖的溶出速率，因而前20 h浸泡液中的葡萄糖含量持續上升；20 h后，乳酸菌的生長處于對數期，對葡萄糖的消耗的速率高于葡萄糖的溶出速率，因而浸泡液中的葡萄糖含量開始下降；40 h后，乳酸菌的生長趨于穩定并開始衰亡，對葡萄糖的消耗量減少，因此浸泡液中的葡萄糖含量又有一定程度的上升。

圖1 玉米浸泡過程中葡萄糖含量的變化曲線Fig.1 The changing curve of glucose in corn steeping process

2.2.2 還原糖含量的變化

浸泡過程中還原糖的變化規律與葡萄糖類似，如圖2所示，在乳酸浸泡的20 h內，浸泡液中還原糖的含量持續上升；酸性蛋白酶作用的20～40 h這段時間內，還原糖含量開始下降，而在40 h后又有一定程度的反彈上升。這是由于浸泡液中還原糖主要是葡萄糖，因此浸泡過程中還原糖的變化規律與葡萄糖一致。

2.2.3 乳酸含量的變化

乳酸的產生與乳酸菌的生長有關，而乳酸菌的生長又與葡萄糖的溶出具有相關性。如圖3所示，在開始乳酸浸泡的20 h內，隨著葡萄糖的浸出，乳酸菌開始生長，浸泡液中的乳酸含量持續上升；酸性蛋白酶作用階段，20～40 h這段時間內，浸泡液中的葡萄糖含量開始下降，乳酸菌的生長變緩，同時玉米粗破碎之后乳酸更容易進入籽粒內部，使得溶液中的乳酸濃度有所下降；隨著浸泡的進行，玉米籽粒對乳酸的吸收逐漸達到飽和，因此在40 h后浸泡液中的乳酸濃度又有一定程度的反彈上升。

圖2 玉米浸泡過程中還原糖含量的變化曲線Fig.2 The changing curve of reducing sugar in corn steeping process

圖3 玉米浸泡過程中乳酸含量的變化曲線Fig.3 The changing curve of lactic acid in corn steeping process

2.3 生物傳感器法與傳統方法結果對比

表1 生物傳感器方法與傳統方法結果對比Table 1 Comparison of results of biosensor methods and those of conventional methods

如表1所示，利用生物傳感器測定浸泡液中葡萄糖、還原糖、乳酸含量，其測試結果與傳統測試方法相差不大。

3 結論

在玉米酶法浸泡過程中，采用生物傳感器測定浸泡液中葡萄糖、還原糖、乳酸的變化規律， 具有響應速度快、結果準確、測試成本低等優點，并且樣品不需要復雜的預處理就可直接測定，該研究為玉米淀粉生產過程優化和控制提供了新的分析方法和理論依據。

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