PPAR?γ激動劑對哮喘小鼠氣道重塑的影響

陳治宇，王宋平（.西南醫科大學，四川瀘州646000；2.西南醫科大學附屬醫院呼吸內一科，四川瀘州646000）

過氧化物酶增值物激活受體（PPAR）是核受體超家族成員，按照編碼基因的不同，主要分為PPAR?α、PPAR?β 及 PPAR?γ。PPAR?γ 主要通過與激動劑結合發揮相應的作用，吡格列酮是PPAR?γ合成激動劑之一。近年研究發現，格列酮類藥物能抑制免疫因子的合成和釋放[1]，從而對肺部疾病達到明顯的抗炎作用。目前的研究大多是關于PPAR?γ激動劑對哮喘的抗炎作用[2]，有關氣道重塑研究較少，且相關作用機制尚不明確。本研究通過建立慢性哮喘小鼠模型，探討PPAR?γ激動劑吡格列酮對慢性哮喘氣道重塑的作用及對肺組織中ADPN表達影響，從而為臨床應用PPAR?γ激動劑治療哮喘奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取6～8周齡雌性C57小鼠24只，體質量（20±2）g，購自重慶騰鑫公司。卵清蛋白（OVA）（美國Sigma公司）、氫氧化鋁、鹽酸吡格列酮片（天津武田藥品有限公司）、小鼠PPAR?γ單克隆抗體購自Ab?cam公司提供、SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（TaKaRa公司）、聚合酶鏈反應（PCR）儀購自杭州博日科技公司、StepOne? Real?Time PCR 儀購自 Life technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 慢性哮喘小鼠氣道重塑模型 采用編號抽簽法，將小鼠分為哮喘組（OVA組）、藥物組（OVA+ROSI組）、正常對照組（Con組），每組8只。參考文獻[3-4]報道的方法，并加以改進制作哮喘模型。OVA組和OVA+ROSI組在0、7、14 d腹腔注射0.2 mL生理鹽水致敏液[OVA 25μg和氫氧化鋁1 mg]致敏，第21天對OVA、OVA+ROSI組經腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，經鼻滴入0.2%OVA溶液，每只20μL，每周3次，持續8周，Con組給予相同容積生理鹽水致敏和激發，OVA+ROSI組每次激發前 1 h 給予吡格列酮[10 mg（kg·d）]灌胃，Con組、OVA組給予相同容積生理鹽水灌胃對照。

1.2.2 肺組織的處理 末次滴鼻24 h后，應用戊巴比妥鈉溶液處死小鼠，取左肺用4%多聚甲醛溶液固定、常規制備病理石蠟切片，HE染色后鏡下觀察各組肺組織中氣道上皮損傷、脫落程度，支氣管氣道壁增厚程度。

1.2.3 氣道重塑相關指標測量 Masson染色觀察膠原沉積程度，使用圖像分析軟件Image?Pro Plus測量氣道膠原沉積的面積，并測氣道壁相關值，每個樣本中依據相關文獻[5]中有關氣道各層的定義，選取相對數量的中小支氣管，分別測量平滑肌內緣內氣管面積（Wam1）、平滑肌外緣內氣管面積（Wam2），支氣管管腔總面積（Wat1）、支氣管總面積（Wat2）、支氣管基底膜周徑（Pbm），使用Pbm標準化，支氣管氣道壁厚度用（Wat2?Wat1）/Pbm 表示，支氣管平滑肌厚度用（Wam2?Wam1）/Pbm表示。

1.2.4 實時熒光定量PCR（real?time PCR）檢測肺組織PPAR?γ、AdipoRs mRNA表達 提取肺組織總 RNA做逆轉錄，用 PPAR?γ、AdipoRs引物進行 RT?PCR 檢測。PPAR?γ 的上游引物 為 5′?GCTTGTGAAGGATG?CAAGGG?3′，下游引物 為 5′?GATATCACTGGAGA?TCTCCGCC?3′，擴增產物片段長度為 225 bp；AdipoR1的上游引物 為 5′?GGGACTTGGCTTGAGTGGTG?3′下游引物 為 5′?AAGTGGACGAAAGCTGCTGC?3′，擴增產物片段長度為240 bp；AdipoR2的上游引物為5′?TAG?GCCTGAGTGGAATCATCC?3′，下游引物為 5′?CAG?CAACCACAAAGATGTGGA?3′，擴增產物片段長度為219 bp；以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參照物，上游引物為 5′?TGAAGGGTGGAGCCAAAAG?3′，下游引物為 5′?AGTCTT?CTGGGTGGCAGTGAT?3′，擴增產物片段長度為227 bp。上述引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

1.2.5 蛋白質免疫印跡法（Western blotting）檢測肺組織中PPAR?γ及ADPN的表達 取小鼠肺組織100 mg，提取總蛋白后，經電泳、轉膜、封閉后，小鼠PPAR?γ、ADPN一抗孵育，采用HRP標記的二抗，以ECL發光液顯色，采用AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，呈正態分布的計量數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett?t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肺組織病理改變 HE染色顯微鏡下可見Con組小鼠氣道上皮結構完整，未發現氣道上皮結構破壞。OVA+ROSI組小鼠氣道上皮結構相對完整，仍可見少許氣道上皮脫落，病理改變較哮喘組減輕，但較Con組病理改變加重，OVA組氣道上皮管腔可見少許分泌物，支氣管壁增厚，支氣管平滑肌肥大，黏膜下水腫，黏膜皺褶增多，氣道上皮多處斷裂和上皮細胞脫落，見圖1。

圖1 各組肺組織病理改變（HE染色，100×）

2.2 利用Masson染色分析測量氣道重塑相關情況Masson染色結果顯示，OVA組氣道上皮下膠原沉積明顯增多，病理改變明顯，而OVA+ROSI組膠原沉積量較OVA組減少，但仍比Con組多（圖2）。經Image?Pro Plus圖像分析軟件測定后，Con組膠原沉積面積最少，所占比例為8.75%，OVA組膠原沉積所占面積44.71%，較Con組明顯擴大，差異有統計學意義（P＜0.05），而OVA+ROSI組膠原沉積面積比約為23.48%，較OVA組減少，仍較Con組面積擴大，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 3。

圖2 各組肺組織病理改變（Masson染色，100×）

圖3 各組肺組織氣道上皮膠原沉積面積

2.3 利用氣道壁厚度變化表示氣道重塑程度 利用Image?Pro Plus圖像分析軟件結果顯示，Con組小鼠氣道壁及支氣管平滑肌厚度測值最低，與Con組比較，OVA組小鼠的氣道壁厚度和平滑肌厚度明顯增厚，差異有統計學意義（P＜0.01），氣道重塑明顯，與Con組比較，OVA+ROSI組小鼠氣道壁厚度和平滑肌厚度減輕，與Con組相比仍升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠支氣管壁、平滑肌厚度比較（±s，μm）

表1 各組小鼠支氣管壁、平滑肌厚度比較（±s，μm）

注：與 Con組比較，aP＜0.01；與 OVA 組比較，bP＜0.01

組別Con組OVA組OVA+ROSI組n8 8 8支氣管壁厚度15.39±0.83 32.18±0.76a 23.84±0.91ab平滑肌厚度3.42±0.27 11.46±1.86a 7.70±0.16ab

2.4 RT?PCR 檢測各組肺組織 AdipoR1、AdipoR2、PPAR?γ mRNA表達水平 以GAPDH作為內參，OVA+ROSI組 PPAR?γ、AdipoR1、AdipoR2 mRNA 水平表達均明顯高于Con組、OVA組，差異均有統計學意義（P＜0.01），OVA 組 AdipoR1、AdipoR2 mRNA 水平表達均較Con組低，差異有統計學意義（P＜0.01），OVA組 PPAR?γ水平表達較Con組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 RT?PCR檢測各組肺組織AdipoR1、AdipoR2、PPAR?γ mRNA水平表達比較（±s）

表2 RT?PCR檢測各組肺組織AdipoR1、AdipoR2、PPAR?γ mRNA水平表達比較（±s）

注：與 Con組相比，aP＜0.01；與 OVA 組比較，bP＜0.01

組別Con組OVA組OVA+ROSI組n8 8 8 Adipor1/GAPDH 0.99±0.125 0.44±0.073a 1.88±0.051ab Adipor2/GAPDH 1.00±0.117 0.46±0.073a 3.13±0.130ab PPARγ/GAPDH 0.96±0.026 2.12±0.147a 4.28±0.164ab

2.5 Western blotting測定各組肺組織中PPAR?γ蛋白及脂聯素（ADPN）的表達 與Con組比較，OVA組及OVA+ROSI組中 PPAR?γ表達增加，OVA+ROSI組較OVA組明顯，肺組織中ADPN表達的檢測中，OVA組較Con組表達減少，OVA+ROSI組較Con組表達增加，見圖4，具體分析結果見圖5、6。

圖4 Western blotting測定肺組織中PPAR?γ蛋白及ADPN的表達

圖5 Western blotting測定肺組織中PPAR-γ蛋白的相對表達

圖6 Western blotting測定肺組織中ADPN的相對表達

3 討 論

支氣管哮喘的主要病理變化包括氣道炎癥及氣道重塑，氣道炎癥引發氣道高反應性，通過釋放細胞因子致使支氣管痙攣，氣道重塑主要表現為氣道壁增厚、氣道平滑肌增生肥大、氣道管腔縮窄、黏膜下新生血管形成、黏膜肥厚增生等改變。氣道重塑引起氣道不可逆阻塞性病變，是導致哮喘病情加重的重要因素之一。

吡格列酮屬于格列酮類藥物，為過氧化物酶增值物激活受體?γ合成類激動劑，臨床上主要作用于脂肪細胞。作為2型糖尿病及代謝綜合征的治療靶點，PPAR?γ是一類由激動劑激活的核轉錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員。目前研究發現，PPAR?γ激動劑主要分為天然激動劑和合成激動劑[6]。PPAR?γ廣泛分布于氣道上皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜酸細胞、平滑肌細胞中，具有一定抑制哮喘炎癥的作用[7]，可能是通過以下相關途徑發揮作用：（1）PPAR?γ通過與激動劑結合后，使PPAR?γ磷酸化，磷酸化后的PPAR?γ參與到MAPK和PI3K相關通路調節；（2）PPAR?γ與激動劑結合后，與過氧化物酶增殖子效應原件（PPRE）相互作用，調節基因轉錄和翻譯等生物學效應并參與脂質代謝，細胞分化、增殖、凋亡；（3）PPAR?γ 通過抑制核因子?κB（NF?κB），活化蛋白?1（AP?1）等相關因子[8]，產生生物學效應。

本研究結果顯示，與OVA組小鼠比較，OVA+ROSI組小鼠氣道上皮細胞損傷程度、膠原沉積面積、氣道壁厚度、平滑肌厚度減輕，差異均有統計學意義（P＜0.01）；OVA+ROSI組小鼠肺組織 PPAR?γ、AdipoR1 和AdipoR2 mRNA、ADPN表達水平較OVA組升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；OVA 組 AdipoR1和 Adi?poR2 mRNA、ADPN表達水平較Con組降低，PPAR?γ表達水平較Con組升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；OVA組小鼠氣道炎癥及重塑情況較Con組加重，差異有統計學意義（P＜0.01）。表明吡格列酮可降低哮喘小鼠氣道炎性反應，與相關文獻報道一致[9]，本研究還發現，吡格列酮可改善哮喘小鼠氣道重塑，其機制可能是激活PPAR?γ促進AdipoRs基因轉錄完成，進而激活AMPK信號轉導途徑，抑制NF?κB活性，從而抑制樹突狀細胞向肺組織遷移，抑制肺組織中嗜酸粒細胞、淋巴細胞的浸潤，減輕肺部炎癥[10?11]，還可以減少血管通透性，還可以通過下調小鼠肺組織中血管內皮生長因子A和缺氧誘導因子等相關因子，同時也可提高哮喘小鼠抗炎因子IL?10水平、降低肺組織Th2炎性因子水平和ROS水平，從而達到抗炎及抑制氣道重塑的作用。PPAR?γ激動劑對哮喘氣道的黏液分泌也有一定作用，有相關動物實驗研究顯示，PPAR?γ也可以通過抑制MUC5AC表達，進而抑制氣道黏液分泌，從而對哮喘有一定的治療作用[12?14]，同時也發現 PPAR?γ 激動劑通過下調CyclinD1的表達，或者是表達相關負調控蛋白并抑制CyclinD1的活性，抑制哮喘氣道炎癥及氣道重塑[15]。

OVA組PPAR?γ表達水平較Con組升高，哮喘時PPAR?γ升高是機體的一種反饋抑制作用，是對氣道炎癥的應答，主要機制可能是由于PPAR?γ作為核轉錄受體，在正常生理條件下在細胞質和細胞核內與輔遏制子結合，無生物活性，激動劑進入細胞質與PPAR?γ結合，PPAR?γ通過結構改變脫離輔遏制子，進入細胞核結合輔激活子，并與PPRE結合調控基因的轉錄，啟動轉錄的活性。只有PPAR?γ進入細胞核內時，才具有生物活性，與相關研究報道一致[16]，OVA組PPAR?γ的表達主要以細胞質為主；而激動組PPAR?γ主要在細胞核中表達，所以PPAR?γ激動劑并不是通過進一步提高體內PPAR?γ的含量，而是通過促進其核轉位而增強其轉錄調控功能。OVA組主要是細胞質中PPAR?γ升高，未進入細胞核，無生物活性[17]。在哮喘小鼠中，PPAR?γ激動劑有一定的抗炎、抑制氣道黏液分泌及抑制氣道重塑的作用，為臨床應用PPAR?γ激動劑治療哮喘提供理論依據，但作用機制尚不完全明確，還需進一步完善相關實驗明確具體機制。

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