調心方對阿爾茨海默病小鼠模型早期學習記憶能力及LTP的影響

梁珍珍，陳 亮（上海市嘉定區安亭鎮黃渡社區衛生服務中心中醫科201805）

阿爾茨海默病（AD）是一種以進行性的學習記憶能力下降及認知功能損害為主要表現的神經退行性疾病。以往研究表明，調心方對改善AD相關指標及臨床癥狀有一定療效，尤其在改善學習記憶能力方面具有較明顯的作用[1?4]。但對于調心方干預AD早期學習記憶下降的研究鮮有開展。針對AD一旦發生，其病理過程將不可逆轉這一趨勢，開展對AD治療時間前移方法的研究，變得尤為重要。本實驗通過小鼠空間學習記憶能力測試及海馬長時程增強（LTP）技術進一步探討調心方干預AD學習記憶下降這一早期臨床表現的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 調心方（黨參20 g，桂枝12 g，菖蒲12 g，白芍 20 g，甘草 6 g，龍骨 60 g，遠志 12 g）由上海市中醫老年醫學研究所自制，鹽酸多奈哌齊片劑購自衛材藥業有限公司，批號：H20050978。

1.1.2 實驗儀器 Morris水迷宮，成儀生物信號采集系統（成都儀器廠），小鼠立體定位儀（NARISHIGE/JA?PAN，09013），多道生理信號采集處理系統RM6240型，ESCORTⅢ型牙科鉆，玻璃電極拉制器（NARISHIGE/JAPAN，PE?22 型）。

1.1.3 實驗動物及分組 APP/PS1雙轉基因3月齡小鼠，體重（20±5）g，共 30 只，由南京大學模式動物研究所提供（實驗動物編號：SCXK1蘇/20100?001），隨機分為模型組、中藥組、西藥組，每組10只；另將C57野生型小鼠8只作為對照組，由南方模式動物中心提供（實驗動物編號：SCCK 滬/2010?0017）。

1.2 方法

1.2.1 實驗給藥 將調心方顆粒劑（3.5 g/kg）、多奈哌齊片劑（1.67 mg/kg）分別溶于168 mL生理鹽水中，分別給予中藥組和西藥組小鼠每天0.2 mL灌胃；其中模型組給予等量生理鹽水灌胃，對照組不干預，周期均為12周。

1.2.2 小鼠學習記憶能力測試 采用Morris水迷宮[5]，將水迷宮平臺設于東南象限正中位置，水池水位高出平臺1 cm，水溫保持在19～24℃。電腦計時設定為70 s，各組小鼠頭部作白色標記后，開始測試。將小鼠放于平臺站立5 s后，從正北象限放入水池中，若小鼠在規定時間70 s未找到平臺，則電腦自動計時潛伏期為70 s；若小鼠提前找到平臺，則電腦自動計時小鼠潛伏期為找到平臺所用時間。然后再將小鼠從正西象限重復此操作，記錄小鼠潛伏期。如此每天訓練2次，連續訓練5 d，記錄各組小鼠潛伏期。

1.2.3 小鼠海馬CA1區LTP記錄

1.2.3.1 電極制備 用玻璃電極拉制器拉制阻抗為3～5 MΩ的玻璃電極，以3 mol/L的KCl液體為電極液注入玻璃電極管內，標準以玻璃電極管尖端在放大鏡下看不到氣泡為準，然后將備好的銀絲插入玻璃電極管內，制備記錄電極；刺激電極為兩根直徑0.1 mm的絕緣銅絲組成的同心圓雙電極，使用之前對其導電性能進行檢測；參考電極為臨床用1寸針灸針。

1.2.3.2 小鼠麻醉及定位 小鼠用20%烏拉坦（由上海中醫藥大學實驗動物中心提供）按照13 g/kg體重行腹腔注射麻醉后，將小鼠立體定位儀按要求安裝完成，用耳桿將小鼠頭部水平固定于小鼠立體定位儀上，保持小鼠呼吸通暢，用手術剪剪開小鼠頭部皮膚，充分暴露顱骨，清除顱骨上的筋膜。用中性筆在小鼠顱骨十字縫處作一標記，開始定位。記錄電極位于海馬CA1區，定位參數為前囟后2.0 mm，中線旁開1.4 mm，刺激深度為硬腦膜下1.5 mm；刺激電極位于同側海馬CA3區，定位參數為前囟后3.8 mm，中線旁開3.0 mm，刺激深度為硬腦膜下1.5 mm[6]。定位完成后，用牙科鉆按照定位標記輕輕鉆開顱骨，將刺激電極與記錄電極依次下到硬腦膜下1.5 mm處，參考電極插于小鼠頭部皮膚處，開始記錄。

1.2.3.3 高頻刺激（HFS）誘導參數 將刺激器設定為強度遞增刺激，強度為0.5 V，波寬0.1 ms，強度增量0.5 V，延時20 ms，進行連續單刺激，以產生最大誘發波群峰電位（PS）幅值的1/2所對應的強度作為刺激強度。基礎記錄采用程控刺激，基礎記錄參數為：波寬0.1 ms，脈沖數1個，組間延時20 ms，循環60次，低通濾波1 000 Hz。待基礎記錄穩定30 min后，用同等刺激強度的HFS誘發LTP，采用程控刺激，刺激參數為：波寬0.1 ms，脈沖數 30個，組間延時20 ms，循環 120次，低通濾波1 000 Hz。

1.2.3.4 誘發基礎波形 記錄HFS后，觀察PS幅值，如果PS幅值較自身基礎刺激PS幅值增強10%以上且持續時間超過30 min，則表明LTP現象已經形成，連續記錄60 min。PS幅值測量方法見圖1。

圖1 PS幅值測量方法

1.2.2.5 數據分析處理 每只小鼠刺激前30 min產生60個PS幅值，以其平均值作為基礎值，刺激前與刺激后共180個PS幅值按每10個PS幅值求1個平均值，將其與基礎值作比較所得出的相對值（%）作為本次實驗的標準值。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，各組間比較采用t檢驗。多組組內比較用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 實驗小鼠 實驗過程中，西藥組小鼠自然死亡2只，LTP實驗過程中，由于手術等原因每組小鼠均出現死亡現象，最終LTP實驗結果中每組均納入5只小鼠。

2.2 調心方對各組小鼠水迷宮潛伏期的影響 對照組、中藥組、西藥組小鼠隨著訓練時間的延長，水迷宮潛伏期時間均呈逐漸縮短趨勢，而模型組小鼠潛伏期時間無明顯變化。與對照組小鼠比較，模型組小鼠潛伏期時間明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.05或0.01）；與模型組小鼠比較，中藥組、西藥組小鼠經過4 d的訓練期，其潛伏期時間明顯縮短，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

2.3 調心方對APP/PS1雙轉基因小鼠誘導LTP的影響 各組小鼠在給予高頻刺激后，成功誘導出LTP（PS幅值增幅達10%以上且維持30 min以上）。與對照組PS增幅比較，模型組PS幅值增幅在各個時段明顯降低，LTP受抑制，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組PS幅值增幅在各個時段明顯增強，LTP水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.01或0.05）；西藥組與模型組的PS幅值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。以上結果表明，調心方可以改善APP/PS1雙轉基因小鼠的LTP水平，從而改善小鼠學習記憶能力，而西藥組改善LTP方面的作用并不明顯。各組小鼠高頻刺激后LTP結果見表2，各組小鼠LTP趨勢圖見圖2。

表1 調心方對各組小鼠水迷宮潛伏期的影響（±s，s）

表1 調心方對各組小鼠水迷宮潛伏期的影響（±s，s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05

第1天62.4±11.63 69.5±1.58a 67.5±7.91 70.0±0.00組別對照組模型組中藥組西藥組第5天43.3±23.29 70.0±0.00b 52.5±17.83c 56.1±18.52c n8 1 0 10 8第2天48.3±15.28 67.2±8.85b 70.0±0.00 70.0±0.00第3天49.6±18.53 67.2±5.98b 70.0±0.00 63.5±12.46第4天49.3±22.02 67.7±6.00a 64.3±15.13 66.0±11.31

表2 高頻刺激后各時間點各組小鼠海馬CA1區群PS幅值變化（±s，%）

表2 高頻刺激后各時間點各組小鼠海馬CA1區群PS幅值變化（±s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

20 min 160.3±14.83 112.0±2.24a 133.5±10.41c 119.4±11.41組別對照組模型組中藥組西藥組60 min 193.7±41.14 115.4±8.29a 136.1±13.88b 122.7±20.66 n5 5 5 5 10 min 152.8±14.43 110.3±3.24a 138.6±14.93c 125.0±18.01 30 min 168.7±28.16 114.5±8.10a 134.2±10.23b 121.0±15.75 40 min 176.5±26.98 115.2±8.31a 135.5±13.06b 126.3±26.33 50 min 188.2±35.79 116.2±7.91a 135.6±10.11b 128.0±25.30

圖2 各組小鼠LTP趨勢圖

3 討 論

海馬電生理具有很強的可塑性，這種可塑性主要表現為LTP和長時程抑制（LTD）。近年來，有關LTP的研究逐漸成為研究學習記憶障礙的熱點。神經細胞之間突觸的可塑性是學習與記憶的神經生物學基礎，與海馬神經元的功能密切相關。海馬神經元是大腦學習記憶能力得以發揮的基礎[7]，而神經電生理的持久改變是學習與記憶得以長期維持的電生理基礎[8]，海馬LTP作為與學習記憶密切相關的電生理現象，是突觸傳遞功能可塑性的重要表現形式之一，是研究海馬記憶功能的重要指標[9]。有研究表明，LTP損傷是APP/PS1雙轉基因小鼠學習認知損害的一個重要指標[10]，APP/PS1雙轉基因小鼠已經成為研究AD的理想模型[11?12]，本模型中小鼠2～3個月皮質和海馬發生膽堿能軸突腫脹，4～5個月開始在杏仁體和海馬出現一些嗜剛果紅斑塊，6個月以后在開始在大腦皮質、海馬和杏仁體形成大量淀粉樣斑塊。3月齡時小鼠正處于病理特征尚未形成或僅有少量形成時期，但已出現記憶下降階段，是研究AD超早期臨床特征的理想時間。

本實驗中采用Morris水迷宮對小鼠AD早期空間學習記憶能力進行檢測，模型組水迷宮潛伏期較對照組潛伏期時間明顯縮短，中藥級、西藥組水迷宮潛伏期較模型組潛伏期時間明顯縮短，其結果顯示模型組小鼠學習記憶能力較對照組明顯降低，中藥調心方在改善APP/PS1雙轉基因小鼠空間學習記憶能力方面具有顯著作用。表明調心方在超早期干預AD學習記憶下降中，具有預防AD向中晚期發展的趨勢。本研究LTP實驗結果顯示，在給予高頻刺激后，各組小鼠的PS幅值增強都達到10%以上，成功誘導出LTP。其中模型組PS幅值增幅在第60分鐘呈下降趨勢，說明學習記憶下降對LTP PS幅值的維持具有一定影響；西藥組PS幅值增幅在高頻刺激后其增長趨勢不穩定，而中藥組的增長趨勢相對穩定，在第60分鐘依然呈上升趨勢，說明中藥調心方在改善學習記憶方面作用穩定。給予高頻刺激后，西藥組PS幅值增強達120%以上，中藥組PS幅值增強達130%以上，西藥組與模型組比較無明顯差異，中藥組與模型組比較，差異顯著。調心方在改善APP/PS1雙轉基因小鼠LTP水平上，具有較顯著作用，至于西藥組對LTP的作用機制有待進一步探討、研究。以上研究結果在以調心方治療AD有效的基礎上，將其治療時間前移，進一步證實了調心方在治療早期學習記憶能力下降中的作用，為調心方運用于AD預防治療提供了重要參考。

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