表皮生長因子受體組織基因突變狀態與自體細胞免疫聯合序貫化放療治療肺癌骨轉移效果的關系分析

苗栓林,曹曉朋,胡麗芳

非小細胞肺癌是我國最常見、病死率最高的惡性腫瘤,其主要類型包括腺癌、鱗癌等小細胞肺癌，約占全部肺癌的80%[1]。由于非小細胞肺癌早期臨床特征不明顯，其檢出率和診斷率低下，患者確診時多為中晚期并伴轉移，其中肺癌骨轉移是其最常見的轉移類型之一，可導致常規手術治療、放化療效果欠佳，嚴重威脅患者的生命安全[2]。由于肺癌骨轉移患者自身條件普遍較差，故放化療治療相對受限[3]。細胞免疫治療作為新型治療技術，對多種惡性腫瘤療效滿意，本研究選擇自體細胞免疫治療(cytokine-induced killer, CIK)聯合序貫放化療治療肺癌骨轉移，探討其應用效果與病理組織表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變狀態的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2015年1月—2017年2月延安大學咸陽醫院收治的肺癌骨轉移91例，男51例，女40例；年齡(48.3±11.6)歲；病程(3.72±1.65)年；病理類型：腺癌48例，小細胞肺癌30例，鱗癌13例；轉移情況：肋骨轉移32例，胸椎轉移28例，腰椎轉移25例，骨盆轉移6例。納入標準：①根據臨床表現和肺癌組織病理活檢確診肺癌，同位素全身骨掃描確診肺癌骨轉移；②符合CIK治療、序貫化放療適應證；③患者和家屬均具備獨立行事能力，了解治療風險，愿意配合治療研究。排除標準：①存在骨結核、骨折、骨惡性腫瘤等疾病；②存在精神心理疾病，難以配合治療。本研究已獲醫院倫理委員會批準。

1.2治療及檢測方法

1.2.1序貫放化療治療方法：全部病例評估治療潛在風險、相關治療適應證，給予序貫放化療治療，即NP化療方案：酒石酸長春瑞濱注射液(江蘇豪森藥業股份有限公司，國藥準字：H20031337)30 mg/m2靜脈注射，第1 d、第8 d；注射用順鉑(山東鳳凰制藥股份有限公司，國藥準字：H20056422)40mg靜脈滴注，第1～3 d。4周為1個療程，連續化療3個療程。化療結束后，應用放療直線加速器(美國瓦里安公司生產)于化療第1 d給予放療，2 Gy/d，每周放療5次。每周10 Gy，總劑量為60 Gy。

1.2.2自體CIK細胞免疫治療方法：化療第1 d同時給予自體CIK細胞免疫治療，常規采集外周靜脈血100 ml，差速離心分離單個核細胞。放入無血清培養基并于37℃孵箱中培養2 h，PBS去除未貼壁細胞，繼續培養并加入購自齊魯制藥有限公司(國藥準字：201612086LAB)的注射用重組人白細胞介素-11注射液(rhIL-11)和購自廈門特寶生物工程股份有限公司(國藥準字：20141127、20160609)的注射用重組人粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)誘導單個核細胞CIK方向分化，加入白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子誘導CIK成熟，經形態學和分子生物標志物鑒定后持續擴大培養，回輸至患者體內，隔日1次，共4次。

1.2.3免疫組化檢測EGFR基因突變情況：CT引導穿刺獲得肺癌組織，乙醇梯度脫水、包埋后石蠟切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，去除內源性過氧化物酶，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復并冷卻至室溫，羊血清封閉后滴加EGFR抗del19和mut21突變抗體(Abcam Technology, Cambridge, UK)，稀釋比例1∶100，4℃孵育過夜；次日依次給予鏈霉素標記的羊抗兔二抗孵育15 min，鏈霉素標記的抗生物素孵育10 min，顯微鏡下DAB顯色1～3 min，流水沖洗10 min，蘇木素復染細胞核2 min，流水再次沖洗10 min返藍，最終經乙醇梯度脫水和二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下評估EGFR突變情況。免疫組化二抗試劑盒及DAB顯色液均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.4基因測序法檢測EGFR基因突變情況：在用實時熒光定量核酸擴增檢測系統(qPCR)方法檢測同時，采用基因測序法檢測EGFR基因突變情況。肺癌組織標本經10%福爾馬林固定、石蠟包埋后切片，直接采用基因測序法檢測EGFR基因是否存在基因缺失、突變情況，初次檢測結果采用引物再次進行反向測序驗證。基因分析儀型號為ABI 3710Genetic Analyzer(美國Applied Biosystems公司)。EGFR測序法檢測相關突變的引物序列如下:del19上游引物：5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCT-3'，下游引物5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'；mut21上游引物：5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'，下游引物:5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'。

1.3觀察指標及方法

1.3.1療效判定：根據中國肺癌骨轉移診療專家共識(2014版)[4]評估自體CIK細胞免疫治療聯合序貫化療的效果，即治療后3個月觀察患者癥狀改善程度，癌灶大小變化。治療有效評價標準為：癌癥所致疼痛、呼吸困難等癥狀緩解甚至消失，肺癌及轉移灶縮小，無明顯不良反應和并發癥。

1.3.2EGFR基因突變評價標準：EGFR基因突變免疫組化檢測的陽性評價標準為細胞內出現棕黃色顆粒，評分包括陽性細胞比例評分和顯色強度評分兩項，二者之積即為該組織EGFR表達評分。每一份標本均由兩名病理科醫師經盲法評估，取平均值作為表達水平進行評分。①陽性細胞評分：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。②染色強度評分：陰性0分；弱陽性1分；中等2分；強陽性3分。評分≤7分視為陰性，評分≥8分視為陽性[5]。

2 結果

2.1臨床療效 91例肺癌骨轉移經治療后有效者70例，有效率達76.92%。

2.2免疫組化檢測結果 EGFR基因突變陽性為細胞內出現棕黃色顆粒。見圖1。治療有效組EGFR基因的del19和mut21突變檢測評分和陽性率均明顯高于治療無效組 (P<0.05)。見表1。

表1 兩組表皮生長因子受體基因突變差異評分和突變陽性率比較

2.3基因測序檢測結果 治療有效組EGFR基因的del19和mut21突變檢出率均明顯高于治療無效組 (P<0.05)。見表2。

表2 兩組表皮生長因子受體基因突變陽性率比較[例(%)]

圖1兩組免疫組化檢測表皮生長因子受體基因突變(SP×200)

A.有效組del19檢測結果;B.有效組mut21檢測結果;C.無效組del19檢測結果;D.無效組mut21檢測結果

3 討論

免疫治療是近年繼手術、放療、化療之后第4種具有治愈惡性腫瘤疾病希望的治療技術。因腫瘤細胞存在較強的免疫逃逸和免疫抑制功能，可有效擺脫正常免疫細胞的殺傷效應[6]。因此，通過誘導和增強機體對腫瘤細胞的免疫力，經免疫系統特異性殺傷腫瘤細胞，成為控制腫瘤生長，最終實現惡性腫瘤治愈[7]的新技術。目前，免疫治療常用的方法主要包括免疫細胞治療、免疫檢查點特征性抑制劑、針對性抗體、溶瘤病毒、特異性癌癥疫苗，其他免疫系統調節劑等，被應用于不同腫瘤的基礎研究和臨床試驗性治療，取得了一定的療效[8]。

近年來，大量惡性腫瘤的免疫治療研究發展迅速，亦成為晚期非小細胞肺癌臨床治療的熱點[9]。本研究基于肺癌發病、發展的特點和原理，選擇自體CIK細胞免疫治療。CIK細胞是主要組織相容性復合物不受限的T淋巴免疫細胞，其分子表現為CD3+CD56+T陽性，具有極快的增殖和復制能力、廣譜抗瘤性和強殺瘤活性[10]。人外周血單個核細胞經科學培養、針對性誘導分化成熟CIK細胞，重新回輸至患者體內，可提高腫瘤細胞識別能力，并通過釋放大量分子靶向毒性顆粒作用于腫瘤細胞膜，裂解腫瘤細胞導致其死亡[11]。此外，與其他自體治療技術一致，具有免疫排斥發生率低、治療相對安全的優勢[12]。

骨轉移是肺癌最常見的轉移部位之一，以肋骨、胸椎、腰椎、骨盆等多見，可致患者骨骼疼痛、功能癱瘓甚至死亡。針對肺癌骨轉移，常規放化療可大規模的殺滅和抑制肺癌細胞，但殘留腫瘤細胞成為日后復發、轉移的重要根源或唯一根源，也是手術、放化療治療失敗的根本原因[13-15]。故輔以CIK細胞免疫治療，可在細胞水平針對殘留的肺癌細胞繼續殺滅并抑制肺癌，極大地降低了復發率、轉移率，延長生存時間，并有效提高其生存質量[16-17]。本研究對全部肺癌骨轉移給予自體CIK細胞免疫治療聯合序貫放化療，有效70例，有效率達76.92%，證實該治療臨床效果確切。

EGFR是ErbB家族的一種跨膜糖蛋白，作為細胞增殖和信號傳導受體，可刺激細胞生長失控、持續生長，最終發生癌變和遠處轉移，如骨轉移、腦轉移等[18-19]。目前，大量研究發現EGFR 基因突變狀態是篩選非小細胞肺癌患者進行酪氨酸激酶抑制劑( TKI) 治療最有價值的指標[20-23]。同時，檢測 19 外顯子 E746-A750 缺失和 21 外顯子 L858R 點突變的 EGFR 基因突變特異性抗體已成為準確、快速和經濟的 EGFR 基因突變篩查方法用。本研究分別采用免疫組化和qPCR法檢測肺癌組織中EGFR基因突變情況，發現自體CIK細胞免疫治療聯合序貫放化療治療有效組EGFR基因突變檢出率顯著高于無效組，即del19和mut21檢出率均顯著高于無效組，提示EGFR基因突變的肺癌骨轉移，給予該方法治療具有更好的療效。

綜上所述，肺癌骨轉移進行自體CIK細胞免疫聯合序貫放化療，療效滿意，且EGFR組織基因突變狀態應用該方法療效更好。

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