EB病毒感染和NK/T細胞淋巴瘤免疫表型相關性研究*

王青利，劉曉娥，肖延風，李 敏，劉曉霞△

1.西安市中心醫院(西安710004)，2.西安交通大學第二附屬醫院(西安710004)

世界衛生組織(WHO)在1997年重新分類了淋巴瘤，確立淋巴結外NK/T細胞淋巴瘤為外周T和NK細胞淋巴瘤，其屬于一種惡性腫瘤，會進行性毀損鼻腔及面中線并和EB病毒(EBV)感染相關。現階段，臨床還沒有統一EBV感染、NK/T細胞淋巴瘤免疫表型等問題[1-2]。NK/T細胞淋巴瘤在淋巴結外原發，具有生物學行為及免疫表型，形態學特殊。NK/T細胞淋巴瘤的瘤細胞能夠將粒酶B、TIA1等一些細胞毒性因子表達出來，通常情況下一方面對T細胞分化抗原進行表達，另一方面對NK細胞相關抗原進行表達，但是目前，臨床還沒有統一其確切的細胞屬性[3]。WHO在1997年充分分類了淋巴瘤，在T細胞淋巴瘤中納入NK/T細胞淋巴瘤，認為其屬于一種高度惡性腫瘤。本研究分析了EB病毒感染和NK/T細胞淋巴瘤免疫表型相關性，現報道如下。

材料與方法

1 材 料 選取西安市中心醫院病理科2008年4月至2013年4月存檔的蠟塊，用4%甲醛固定標本，石蠟包埋、H-E染色，經免疫組織化學(CD20、CD45RO、CD56、CD3ε)和組織學形態分析，進一步進行免疫組織化學染色[粒酶B、T細胞內抗原1(TIA1)]，EBER1/2原位雜交檢測，明確診斷為NK/T細胞淋巴瘤。所有患兒均具有完整的臨床資料并將接受過放化療治療等患兒排除在外。其中男16例，女9例，年齡1～7歲，平均(4.2±0.4)歲。疾病部位：鼻腔19例，鼻咽3例，腭部2例，口咽1例。另選取鼻咽反應性增生淋巴組織20例作為對照組，其中男13例，女7例，年齡2～7歲，平均(4.6±0.3)歲。兩組患者的年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2.1 免疫組織化學鏈霉素抗生物素-過氧化酶連接法檢測：福州邁新生物技術公司生產的CD20、CD45RO、CD56、粒酶B單克隆抗體、CD3ε多克隆抗體及SPS免疫組織化學試劑盒，DAKO基因有限公司生產的TIA1、LMP1單克隆抗體。切片，厚度為4 μm，常規脫蠟至水，用3% H2O2對內源性過氧化物酶進行10 min的阻斷，微波將修復抗原煮沸，10%正常山羊血清進行10 min的封閉，將第1抗體加入其中，在4 ℃的溫度下過夜。將第2抗體加入，其標記物為生物素，室溫下進行30 min的孵育。將鏈酶卵白素加入，其標記物為辣根酶，室溫下進行10 min的孵育。DAB、蘇木精顯色、復染，常規脫水、透明、封固。將陽性對照設定為試劑公司生產的陽性片，將陰性對照設定為PBS，將一抗取代掉。

2.2 原位雜交檢測EBER1/2：應用DAKO Y5200EBER-肽核酸(PNA)寡核苷酸探針EBER1/2及其配套試劑盒，其是一種小分子RNA，針對EBV編碼，標記物為異硫氰酸熒光素(FITC)。切片，厚度為4 μm，常規脫蠟至水，室溫下進行10 min的處理，在此過程中將3% H2O2充分利用起來，蛋白酶進行20 min的消化，將EBER-PNA探針滴加其中，將Sigma公司生產的硅化蓋片蓋上。在55℃的烤箱、洗液中分別進行2 h的孵育、25 min的振蕩洗滌，將標記物為兔抗FITC/堿性磷酸酶(AP)的抗體滴加其中，室溫下進行30 min的放置。進行1 h的顯色，在此過程中將五溴-四氯-三吲哚磷酸脂/氮藍四唑(BCIP/NBT)充分利用起來。復染時間為核快紅時，在此過程中將甲基綠充分利用起來。常規脫水、透明、封固。分別應用陽性對照探針和陰性對照探針，位置為在T細胞淋巴瘤上，其已知EBV陽性。

3 結果判斷 CD20、CD45RO、CD56蛋白，CD3ε、粒酶B、TIA1蛋白，EBER1/2，潛伏膜蛋白1(LMP1)的陽性標準分別為細胞膜呈棕黃色染色，細胞質呈棕黃色顆粒狀染色，細胞核呈紫藍色、細胞膜及細胞質不著色，細胞質及細胞膜呈棕黃色著色[2]。

4 統計學方法 采用SPSS 10.0統計學軟件分析，計數資料采用百分比表示，差異性檢驗采用Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 組織學特點 25例患者均有一定程度的炎性細胞浸潤，凝固性壞死，多形性淋巴樣瘤細胞彌漫或散在分布，主要為中等細胞及大細胞，有血管中心性浸潤12例。

2 免疫標記 CD20陽性0例，CD45RO陽性25例(100.0%)，CD56陽性21例(84.0%)，CD3ε陽性25例(100.0%)，粒酶B陽性22例(88.0%)，TIA1陽性25例(100.0%)。

3 EBV感染 EBER1/2陽性21例(84.0%)，LMP-1陽性12例(48.0%)，EBER1/2、LMP-1均陽性12例(48.0%)。20例反應性增生淋巴組織EBER1/2、LMP-1陽性均為0例，差異有統計學意義(P<0.05)。

4 相關性 EB病毒感染和NK/T細胞淋巴瘤免疫表型顯著相關(r=12.562，P=0.002)。

討 論

NK/T細胞淋巴瘤在淋巴結外原發，具有生物學行為及免疫表型，形態學特殊。NK/T細胞淋巴瘤的瘤細胞能夠將粒酶B、TIA1等一些細胞毒性因子表達出來，通常情況下一方面對T細胞分化抗原進行表達，另一方面對NK細胞相關抗原進行表達，但是目前，臨床還沒有統一其確切的細胞屬性。WHO在1997年充分分類了淋巴瘤，在T細胞淋巴瘤中納入NK/T細胞淋巴瘤，認為其屬于一種高度惡性腫瘤。本研究結果表明：25例NK/T細胞淋巴瘤CD45RO陽性25例，CD56陽性21例，CD3ε陽性25例，粒酶B陽性22例，TIA1陽性25例，陽性率分別為100.0%、84.0%、100.0%、88.0%、100.0%，說明細胞毒T淋巴細胞或NK細胞是NK/T細胞淋巴瘤的瘤細胞的主要來源。越來越多的研究均表明[4-5]，絕大部分NK/T細胞淋巴瘤的瘤細胞能夠檢測出EBV基因組。分析TCRγ基因重排與免疫表型，結果顯示，NK/T細胞淋巴瘤是一組臨床病理類型具有獨特性和EBV高度相關，可能從細胞毒性淋巴細胞起源，其屬于T及NK細胞系列，受EBV感染和轉化[6]。臨床普遍認為[7]，和鼻咽癌及Hodgkin病的感染模式相比，NK/T細胞淋巴瘤中的EBV潛伏模式相同，將LMP-1等表達出來。

現階段臨床還沒有統一NK/T細胞淋巴瘤中EBV感染屬于伴隨現象還是屬于致病因素，還沒有弄清楚EBV的致瘤機制，可能有以下兩種途徑，即EBV對宿主細胞造成感染后，EBV基因向宿主基因組中整合，在該作用下，宿主基因組有突變發生，從而促進腫瘤的發生；EBV編碼產物將良好的前提條件提供給了腫瘤的發生，比如，LMP-1屬于一種致瘤性潛伏膜蛋白，編碼主體為EBV，能夠對細胞DNA損傷修復進行抑制，同時還能夠將PI3K/Akt通路等激活，從而為腫瘤發生提供良好的前提條件[8]。EBV的易感部位為鼻腔/鼻咽部，研究表明[9-11]，EBV和NK/T細胞淋巴瘤的關系極為密切，EBER達到了80%～90%的陽性率，不同種族之間具有相似的相關性。EBER的編碼主體也為EBV，其屬于一種功能性RNA，能夠調節細胞的生長，在細胞核內存在，每個細胞有107拷貝數，檢測具有較高的敏感度，能夠將有效依據提供給臨床對EBV感染的判斷[12-14]。EBER-1、EBER-2是兩種小分子RNA，轉錄主體為EBV，在EBV潛伏感染的細胞核中大量存在，在核內EBER能夠結合La蛋白等兩種及以上的細胞內蛋白質，和核糖核蛋白相似，同時在穩定的二級結構中存在，但是并不對蛋白質進行編碼，為EBV感染病毒病因學研究提供了有效依據[15]。本研究結果表明，EBER1/2陽性21例，LMP-1陽性12例，陽性率分別為84.0%、48.0%，EBER1/2、LMP-1均陽性12例。反應性增生淋巴組織20例，EBER1/2陽性0例，LMP-1陽性0例，陽性率均為0，差異有統計學意義(P<0.05)，說明在組織學診斷NK/T細胞淋巴瘤的過程中，LMP-1免疫組織化學檢測、EBER1/2原位雜交檢測可作為組織學診斷的輔助依據。

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