烤煙游離氨基酸與感官品質的關聯及烘烤過程的變化規律研究

過偉民，郭建華，董洪旭，徐磊，韓加所，劉偉，王濤，張仕祥，張艷玲，牟文君

1 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，煙草行業生態環境與煙葉質量重點實驗室，河南鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001；

2 陜西中煙工業有限責任公司，技術中心，陜西寶雞高新大道100號 721000；

3 曲靖市煙草公司沾益分公司，生產科，云南曲靖珠江源大道1415號 655331；

4 云南省煙草公司曲靖市公司，技術中心，云南曲靖麒麟區南寧北路196號 655000

氨基酸是煙草中重要的含氮化合物，也是香氣的主要來源之一[1]。煙葉在調制、醇化過程中，氨基酸與還原糖發生的非酶促棕色化反應（美拉德反應）是煙草中一類重要的致香反應，可形成對煙草香味有重要影響的吡咯、吡嗪和呋喃類化合物，某些氨基酸（如苯丙氨酸）還可直接分解為苯甲醇、苯乙醇等香味物質[2-3]。有報道發現，美拉德反應產物(MRPs)作為基礎香味物質或香味前體物，含量可占煙葉重量的1.5%～2.0%[4-5]。因此，明確煙葉氨基酸與品質的關聯規律，煙葉烘烤過程氨基酸參與美拉德反應的機制等，對生產環節的有效調控和改善煙葉品質有重要意義。目前，關于氨基酸與煙葉品質的關聯規律報道不一致，如王樹聲等[6]分析了31份不同產區煙葉，認為絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、酪氨酸與評吸質量正相關，亮氨酸、脯氨酸、游離氨基酸總量與評吸質量負相關。鄧國賓等[7]分析了云南某產區23份煙葉，認為纈氨酸、賴氨酸與評吸質量負相關，絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸等與評吸質量正相關。吳文斗等[8]分析了6個省份118份煙葉，認為脯氨酸、精氨酸與評吸質量正相關，纈氨酸、谷氨酸與評吸質量負相關。從上述報道中看出，煙葉游離氨基酸與感官質量存在相關性，但相關性強的組分不一致，甚至存在同一氨基酸相關性相反的不同報道，產生這一問題的主要原因可能是煙葉氨基酸的區域差異[9-10]，不考慮區域間差異而籠統地分析難以得到準確結果。另一方面，作為美拉德反應最重要的底物，氨基酸在烘烤過程中的變化及與美拉德反應的關系報道極少，研究者多采用單一氨基酸或少數幾種氨基酸混合物與還原糖組成簡單模型體系(Model systems)進行反應[11-14]，研究不同氨基酸的反應活性和主要影響因素，但簡單模型體系得出的結果與實際應用往往存在較大差距[15]。

基于此，本文首先跟蹤分析了我國6個產區不同部位初烤煙葉的游離氨基酸含量，系統研究了游離氨基酸與煙葉感官品質的關系，篩選了與品質穩定關聯的氨基酸，又進一步分析了煙葉烘烤過程中游離氨基酸含量和組成的變化，探討了烘烤過程與美拉德反應有關的可能氨基酸，為煙葉品質評價和生產環節的有效調控提供支撐。

1 材料與方法

1.1 煙葉采集與樣品制備

2015—2016年采集我國3類香型6個產區中部（9～13葉位）和上部（16～18葉位）初烤煙葉，品種為當地主栽品種。每產區選定1～2個代表性站點，3～4戶代表性煙農，每戶煙農相應部位煙葉烘烤結束后，隨機采集未經挑選和分級的煙葉，每產地每年采集煙葉120～160 kg。根據煙葉分級國標[16]規定的品質因素，制備各品質因素不同檔次的煙葉樣品（如顏色制備深桔黃、桔黃、檸檬黃、雜色、微帶青；成熟度制備成熟、尚熟；油分制備多、有、稍有等），所制備樣品基本涵蓋各產地煙葉可能出現的各種質量檔次。2年共制備樣品335個，具體見表1。

表1 制備樣品信息Tab.1 Information of flue-cured tobacco samples

1.2 煙葉烘烤試驗設計

實驗于2016年在云南省曲靖市沾益縣進行，供試品種為云煙100。選擇地勢平坦的連片煙田，煙葉正常成熟采收后，挑選鮮煙素質基本一致的煙葉（700片左右）用于烘烤過程取樣。所挑選煙葉編竿標記后隨其他煙葉分別裝入3座烤房（標準化密集烤房）正常烘烤，從采收時開始，每座烤房每24 h取樣1次至烘烤結束，共取樣8次。具體取樣方法：每次隨機采集20片煙葉后立即置于-20℃冷柜保存，煙葉樣品采集完成后統一冷凍干燥（LABCONCO，FreeZone2.5Plus, 美國）。

1.3 煙葉樣品分析方法

1.3.1 游離氨基酸測定

采用氨基酸自動分析儀（Hitachi 8900，日本）測定煙葉樣品中的游離氨基酸，具體方法參照行業標準[17]。共檢出21種游離氨基酸，包括18種蛋白氨基酸和3種非蛋白氨基酸，其中非蛋白氨基酸為組成蛋白質的二十種常見氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物[18]，包括β-丙氨酸（β-Ala）、β-氨基異丁酸（β-AiBA）、γ-氨基丁酸（γ-ABA）。蛋白氨基酸可按側鏈結構不同進行分類[19]，包括芳香族：苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）；酸性：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）；堿性：賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）；脂肪族：丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）；含羥基類：蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）；含硫類：胱氨酸（Cys）；酰胺類：天冬酰胺（Asn）；亞氨基酸類：脯氨酸（Pro）。

1.3.2 感官品質評價

煙葉感官品質評價由我國主要卷煙工業企業產品配方人員組成的感官質量鑒定專家組完成。評價指標包括香氣質、香氣量、濃度、勁頭、雜氣、刺激性、余味、工業可用性，具體方法參照文獻[20]。為避免評吸人員、評價時間不同對結果可比性的可能影響，保證同產區、同年份的樣品由同一組評吸專家（7人）在同一時間完成。

1.4 數據分析方法

參考中國煙草種植區劃建立的烤煙感官質量綜合評價方法[20]，以（香氣質分值×0.30+香氣量分值×0.30+雜氣分值×0.08+刺激性分值×0.15+余味分值×0.17）×11.11作為感官綜合質量表征分值。采用相關分析方法，分析煙葉游離氨基酸含量與感官質量分值的相關性。

1.5 數據處理

采用SPSS v19.0軟件進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸與煙葉感官品質的關聯分析

2.1.1 游離氨基酸含量與感官品質分值的散點圖

煙葉游離氨基酸含量與感官品質分值的散點圖見圖1～圖8（限于文章篇幅，僅展示滇東、湘南2類產區結果）。總體來看，隨游離氨基酸含量的升高，煙葉的感官品質分值存在下降趨勢。

圖1 芳香族氨基酸含量與感官品質分值的散點圖Fig.1 Scatter diagram of aromatic amino acids concentration and smoking quality scores

圖2 酸性氨基酸含量與感官品質分值的散點圖Fig.2 Scatter diagram of acid amino acids concentration and smoking quality scores

圖3 堿性氨基酸含量與感官品質分值的散點圖Fig.3 Scatter diagram of basic amino acids concentration and smoking quality scores

圖4 脂肪族氨基酸含量與感官品質分值的散點圖Fig.4 Scatter diagram of aliphatic amino acids concentration and smoking quality scores

圖5 含羥基類、酰胺類氨基酸含量與感官品質分值的散點圖Fig.5 Scatter diagram of hydroxyl-containing, amide amino acids concentration and smoking quality scores

圖6 含硫類、亞氨基酸含量與感官品質分值的散點圖Fig.6 Scatter diagram of sulfur-containing, Imino amino acids concentration and smoking quality scores

圖7 非蛋白氨基酸含量與感官評吸分值的散點圖Fig.7 Scatter diagram of non-protein amino acids concentration and smoking quality scores

圖8 游離氨基酸總量與感官評吸分值的散點圖Fig.8 Scatter diagram of total amino acids concentration and smoking quality scores

2.1.2 游離氨基酸含量與感官品質分值的相關分析

不考慮區域、部位的差異，將所分析的3類香型6個產區數據合并分析，游離氨基酸含量與感官品質分值的相關系數結果見圖9。從圖中看出，除Cys,Pro, β-AiBA外，其余氨基酸與感官品質呈顯著或極顯著負相關，2年規律一致。

圖9 煙葉游離氨基酸與感官品質分值的相關系數Fig.9 Correlation coefficient of free amino acids concentration an smoking quality

考慮到不同產區煙葉游離氨基酸含量的差異，不同評吸專家組感官品質評價分值的系統性差異，進一步區分產區和部位，考察了游離氨基酸含量與感官品質的相關性規律。從表2中看出，芳香族、酸性和堿性氨基酸與感官品質多呈負相關關系，所分析的接近半數或以上樣品組表現出顯著相關性，其中Lys在所分析的絕大多數樣品組與感官品質分值呈顯著負相關，說明這種關聯規律基本不受評吸人員變化、年份波動、產區差異等因素的影響。從表3中看出，脂肪族氨基酸中的Ala和酰胺類氨基酸Asn兩種氨基酸與感官品質的關聯規律較穩定。從表4中看出，非蛋白氨基酸中的γ-ABA與感官品質的關聯規律較穩定。煙葉中含量最高的Pro和游離氨基酸總量與感官品質的關聯規律不明顯，多數樣品組相關性不顯著。

表2 不同產區芳香族、酸性、堿性游離氨基酸含量與感官品質分值的相關系數Tab.2 Correlation coefficient of aromatic,acid,basic amino acids concentration and smoking quality in different planting areas

表3 不同產區脂肪族、含羥基、酰胺類氨基酸含量與感官品質分值的相關系數Tab.3 Correlation coefficient of aliphatic, hydroxyl-containing, amide amino acids concentration and smoking quality in different planting areas

表4 不同產區含硫類、亞氨基酸、非蛋白氨基酸含量及游離氨基酸總量與感官品質分值的相關系數Tab.4 Correlation coefficient of sulfur-containing, imino, non-protein amino acid, total amino acids concentration and smoking quality in different planting areas

2.2 烘烤過程中游離氨基酸的變化

Wahlberg等[3]認為，美拉德反應是煙葉烘烤過程香味物質形成的主要途徑之一。氨基酸作為美拉德反應最主要的底物，其參與烘烤過程的美拉德反應可能是與烤后煙葉感官品質產生關聯的主要因素。因此，進一步分析了烘烤過程中游離氨基酸含量和組成的變化。

2.2.1 游離氨基酸含量

烘烤過程中煙葉游離氨基酸含量的變化見圖10。堿性和芳香族氨基酸的變化規律相似，總體表現為先大幅度上升（烘烤開始～變黃中期）后逐漸下降（變黃中期～烘烤結束）。酸性氨基酸的變化規律不明顯，Asp在烘烤開始階段明顯下降后保持穩定，Glu的主要變化為烘烤開始階段的上升和變黃中后期的下降。脂肪族氨基酸的變化規律差異較大。羥基氨基酸的變化規律相似，主要表現為烘烤開始階段的上升和變黃中后期的下降。含硫氨基酸（Cys）在烘烤過程中存在緩慢上升趨勢。煙葉中含量最高的亞氨基酸（Pro），烘烤過程中總體表現為上升趨勢，最后階段有所下降。γ-ABA在烘烤過程中的變化趨勢與其他氨基酸有所不同，總體呈持續下降趨勢。綜合來看，多數氨基酸含量在烘烤過程中表現為先上升后下降，堿性和芳香族氨基酸的倒“V”型變化規律最為明顯。

圖10 煙葉烘烤過程游離氨基酸含量的變化Fig.10 Variation of free amino acid concentration during fluecuring process

2.2.2 游離氨基酸組成

為進一步探討烘烤過程中各游離氨基酸的相對變化，分析了游離氨基酸組成狀況的變化趨勢（圖11）。堿性、芳香族氨基酸在占總氨基酸比例在經歷烘烤開始階段的上升后，持續下降趨勢明顯，如Lys由變黃前期最高1.27%逐漸下降至烘烤結束的0.09%，Phe由變黃前期最高3.47%逐漸下降至烘烤結束的0.72%，說明這兩類氨基酸在進入變黃前期后的下降速度相對大于其他種類氨基酸。酸性氨基酸中的Asp占總氨基酸比例在烘烤開始階段明顯下降后保持穩定，Glu占比則在變黃階段明顯下降。脂肪族氨基酸中，Ala占比在烘烤中后期（96H～結束）的逐漸下降趨勢明顯。羥基氨基酸占總氨基酸比例在烘烤前期明顯下降，進入變黃中期后的變化不明顯。γ-ABA占總氨基酸比例在烘烤過程呈持續下降趨勢，由鮮煙葉的20.9%下降至變黃結束（72H）的3.1%，隨后逐步下降至烘烤結束的0.8%。Pro占總氨基酸比例由鮮煙葉的接近50%，逐漸上升至變黃結束的接近80%，后期保持穩定。

圖11 煙葉烘烤過程中游離氨基酸組成的變化Fig.11 Variation of free amino acid composition during flue-curing process

3 討論

本研究通過系統分析連續2年我國不同產區的煙葉，發現烤煙游離氨基酸含量與感官品質存在負相關關系。堿性氨基酸、芳香族氨基酸和酸性氨基酸中的Glu, 脂肪族氨基酸中的Ala, 酰胺類氨基酸Asn, 非蛋白質氨基酸中的γ-ABA與感官品質的負相關規律較為穩定，受評吸人員變化、年份波動、產區差異等因素的影響較小。

多數游離氨基酸含量在烘烤過程中表現為先上升后下降，以堿性和芳香族氨基酸的倒“V”型變化規律最為明顯，γ-ABA的逐漸下降趨勢最為明顯。與前人[21]對攀枝花產區16種氨基酸含量在烘烤過程的變化結果相比，多數氨基酸先上升后下降的總體規律相似，Pro（含量最高氨基酸）持續上升，最后階段下降的規律相似。游離氨基酸組成的變化主要反映各氨基酸的相對變化，前人尚無報道，堿性、芳香族氨基酸占總氨基酸比例的變化規律相對明顯，進入變黃中期后持續下降，γ-ABA占比的趨勢相似，說明這3類（種）氨基酸在烘烤中后期的相對下降趨勢強于其他種類氨基酸。

結合品質關聯分析和烘烤過程變化分析結果，多數與品質穩定負關聯的氨基酸，烘烤中后期的持續下降趨勢也最為明顯，提示延長烘烤中后期的時間，有利于降低品質負關聯的氨基酸，改善烤后煙葉感官品質。從烘烤過程的美拉德反應角度來看，眾多研究[11,22]表明，美拉德反應速度隨溫度的升高而加快，煙葉烘烤過程中溫度逐漸上升，理論上美拉德反應逐漸加劇。目前關于煙葉烘烤環境中的美拉德反應關鍵氨基酸尚無報道，但根據前人在簡單加熱模型體系（100℃以上）的相關研究[13-14]，Lys的美拉德反應活性最強，其次為Trp、Tyr、Arg、Phe和Gly，Pro、Cys等活性較弱。對比本文結果不難發現，品質穩定負關聯的氨基酸多為高溫體系中美拉德反應活性強的氨基酸，其在烘烤中后期（相對高溫階段）的下降趨勢也相對較強，提示堿性、芳香族氨基酸與煙葉感官品質的穩定負關聯可能與其參與美拉德反應活性強有關。

4 結論

初烤煙葉中的堿性、芳香族等氨基酸與感官品質的負關聯規律在不同產區、年份表現穩定，游離氨基酸指標應用于煙葉品質評價具有較好前景，在進一步數據驗證基礎上，可建立煙葉游離氨基酸指標的適宜范圍和評價方法。烘烤過程中多數游離氨基酸存在先上升后下降的變化趨勢，堿性、芳香族和γ-ABA等品質穩定負關聯氨基酸在烘烤中后期的下降趨勢相對較強，可能與其參與美拉德反應活性強有關，烘烤過程可通過延長中后期時間或調控溫濕度，針對性降低煙葉游離氨基酸含量，以改善烤后煙葉感官品質。