生物炭基肥對植煙土壤微生物功能多樣性的影響

常棟，馬文輝，張凱，王曉強，何曉冰，許躍奇，徐放達

河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467000

生物炭是指生物有機材料（農作物秸稈、雜草、糞便等生物質）在缺氧或低氧環境中通過高溫裂解后的固體產物[1]。其含碳量極高，施入土壤后不僅能增加土壤中的有機質含量、提高肥力，而且耐降解，因而可以提高碳在土壤中的封存時間[2]。近年來，在全球氣候變暖與能源、糧食危機日益蔓延的大背景下，有關生物炭的研究得到了學者的廣泛重視，并取得了顯著的研究進展[3-6]。

微生物是土壤生態系統的重要組成部分，其在土壤養分循環、有機碳的礦化-固定過程中起著關鍵作用[7]。由于微生物分布廣泛、對環境敏感，且在生態系統中具有不可替代的作用，被越來越多地用于土壤肥力評價中[8-9]。現有研究表明，生物炭在調控土壤微生物群落結構和多樣性方面發揮著重要作用[10-13]。

豫中煙區是我國濃香型烤煙的重要產區之一，由于耕地資源有限，烤煙連作種植年限較長，加上化學肥料使用不合理，造成植煙土壤結構變差、養分供應不均衡、微生物多樣性和生物活性降低等問題，嚴重影響了優質煙葉生產的可持續發展，因此，煙田土壤改良十分必要。近些年，生物炭在煙田土壤改良中的研究廣泛開展[14-18]。目前，生物炭主要來源于農業廢棄物，其本身所含養分有限，單獨施用并不能滿足作物生長的需要[19]。而以生物炭為承載體，與其他類型肥料混合制成的生物炭基肥彌補了生物炭養分不足、消耗量大等問題，同時減少化肥用量、改善土壤微生態環境、提高養分利用率和作物品質[20-21]。生物炭基肥在河南、江西、陜西、湖南、貴州等產區的示范效果良好。目前，關于生物炭基肥對植煙土壤微生物生態的研究較少。本文以河南省郟縣典型植煙土壤為研究對象，在大田環境下，分析添加不同用量生物炭基肥對土壤微生物功能多樣性的影響，以期為合理的烤煙施肥措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地位于河南省郟縣茨芭鎮，東經113.08°，北緯34.07°，海拔224 m，主要種植作物為煙草，屬暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫14.6 ℃，≥ 10℃ 年活動積溫4734.9 ℃，無霜期220 d左右，年平均日照時數2232 h，日照率50%。年平均降雨量680 mm，7 ～ 9月份降雨量占全年的70% 左右，屬丘陵干熱少雨區，高溫期與多雨期同步，土壤類型為壤土。

1.2 試驗設計

試驗于2017年進行，采用隨機區組設計，共設4個處理：施用化肥（B0）；化肥 + 0.9 t·hm-2生物炭基肥（B60）；化肥 + 1.5 t·hm-2生物炭基肥（B100）；化肥 + 2.1 t·hm-2生物炭基肥（B140）。各個試驗小區化肥氮素用量 52.5 kg·hm-2，N∶P2O5∶K2O 施用比例為 1∶1∶3.5，各處理重復 3 次，小區面積約 130 m2，生物炭基肥全部用作基肥條施。試驗所用生物炭基肥為河南寶融生物科技有限公司生產，生物炭種類為秸稈炭，有機質含量60%，全氮含量2.5%，全磷含量0.56%，全鉀含量3.4%，pH為7.7。大田管理按照平頂山市煙葉生產管理標準體系相關操作規程進行。烤煙供試品種為中煙100。

1.3 樣品采集與預處理

在煙草旺長期（移栽后60 d）按5點采樣法采集煙株根系附近0 ～ 20 cm土壤，剔除土壤樣品中石塊和植物殘根等雜物，混勻過2 mm篩，放入4℃冰箱保存。對采集的土壤樣品進行微生物碳源利用多樣性、酶活性和化學指標的測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 土壤養分指標測定

將土壤樣品置于室內自然風干后過篩。有機碳（SOC）含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定，堿解氮（AN）含量采用堿解擴散法測定，速效磷（AP）含量的測定采用0.5mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，pH測定采用電位法測定，固液比為1∶2.5[22]；硝態氮和銨態氮采用連續流動分析儀測定，微生物量碳（MBC）采用熏蒸浸提-重鉻酸鉀容量法測定，土壤微生物量氮（MBN）采用熏蒸浸提法測定[23]。

1.4.2 土壤微生物群落功能多樣性分析

土壤微生物碳源利用多樣性采用Biolog Eco微平板測定。微平板中31種底物劃分為6類[24]：碳水化合物（D-半乳糖酸-γ內脂，β-甲基-D-葡萄糖苷，D-纖維二糖，α-D-乳糖，i-赤蘚糖醇，α-D-葡萄糖-1-磷酸，D-木糖，D-甘露醇，N-乙酰-D葡萄糖胺，D,L-α-磷酸甘油），氨基酸（L-天門冬酰胺，L-苯基丙氨酸，L-精氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，甘氨酰-L-谷氨酸），羧酸（γ-羥基丁酸，衣康酸，α-丁酮酸，D-蘋果酸，丙酮酸甲酯，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖胺酸），多聚物（α-環式糊精，肝糖，吐溫40，吐溫80），酚酸（2-羥基苯甲酸，4-羥基苯甲酸），胺類（苯乙胺，腐胺）。稱取相當于5 g烘干土重的新鮮土樣，加入盛有45 mL已滅菌的0.85% NaCl溶液錐形瓶中，密封震蕩30 min后，稀釋至1∶1000。將Biolog Eco微平板從冰箱取出，預熱至20℃，將稀釋液接種到平板中，每孔接種量為150 μL。在28℃下連續培養7 d，每隔24 h用Biolog自動讀數儀在590 nm下讀數[25]。

1.4.3 土壤酶活性的測定

土壤酶活性的測定依照關松蔭的方法[26]。

1.5 數據處理

每孔平均顏色變化率（average well colour development, AWCD），用以衡量微生物利用不同碳源的整體能力[27]，是微生物群體活性的有效指標，值越大表示土壤微生物密度越大、活性越高。

式中，Ci為各反應孔在590 nm下的吸光值；R為對照孔A1（用水代替碳源）的吸光值；當Ci-R＜0時，在計算中記為0。本研究采用Biolog Eco微平板培養96 h的數據計算群落豐富度指數（S），Shannon多樣性指數（H），Simpson多樣性指數（D），McIntosh多樣性指數（U）和Shannon均一性指數（E），其中S是微生物可以利用的碳源數目（OD590＞0.5）代表該孔碳源被利用，H反映群落物種及其個體數和分布均勻程度的綜合指標，受群落物種豐富度影響較大。D較多反映了群落中最常見的物種優勢度。U是群落物種均一性的度量。E反映了Shannon指數的均勻度，計算公式如下[28-29]：

其中，Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)，ni=Ci-R，E=H/lnS。

試驗數據利用Excel 2013進行初步處理，使用SPSS 20.0進行統計分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey HSD法多重比較檢驗各處理間的差異顯著性（P＜0.05），利用R語言進行主成分分析和熱圖制作。

2 結果與分析

2.1 生物炭基肥對土壤化學和生物化學性質的影響

各處理耕層土壤化學和生物化學性質如表1和表2所示。添加生物炭基肥后土壤pH均有所提高，B60和B140顯著高于B0和B100。土壤AN和AP含量表現為B100顯著高于其他各處理。B0處理的SOC含量顯著低于添加生物炭基肥的處理。添加生物炭基肥后，MBC和MBN含量均有增加，其中B100和B140處理之間沒有顯著性差異，但均顯著高于B0。土壤礦質氮含量在B100和B140之間沒有顯著性差異，但顯著低于B0處理，B60處理的礦質氮含量顯著低于其它處理。B0處理的土壤微生物熵（qmic）與添加生物炭基肥處理沒有顯著性差異，僅B60處理顯著低于B140處理。

表1 不同施肥處理下的土壤性質Tab.1 Soil properties under different fertilization treatments

表2 不同施肥處理下的土壤酶活性Tab.2 Enzyme activities affected by fertilization treatments

添加生物炭基肥處理的土壤蔗糖酶和多酚氧化酶活性均比B0處理有所提高，但差異沒有達到顯著水平，脲酶活性表現為B140處理顯著高于B0和B100。

2.2 生物炭基肥對土壤微生物功能多樣性的影響

對不同處理每隔24 h測定OD值，計算平均顏色變化率（AWCD）。各處理烤煙根域土壤微生物對不同碳源的利用程度均隨培養時間的增加而增大。在培養的前24 h里各處理間沒有顯著差異且接近于0，隨后碳源被迅速利用，AWCD值急劇增加并表現為 B100＞B140＞B60＞B0，而在 96 h 之后變幅逐漸降低。在培養至144 h時B0處理AWCD值最低為1.32，分別為B60、B100和B140處理的98%、81%和80%，表明施用生物炭基肥增加了微生物能源物質，提高了土壤微生物活性，尤其B100和B140處理最為顯著。

圖1 生物炭基肥對土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）的影響Fig. 1 Variation in average well-colour development (AWCD) over time in Biolog Ecoplates

微生物的種類以及豐度是影響微生物活動的主要因素之一。為了進一步確定不同用量的生物炭基肥對土壤微生物多樣性的影響，各施肥處理土壤培養96 h的微生物功能多樣性指數見表3。研究結果表明，增施生物炭基肥能有效的改善土壤微生物群落功能多樣性。B100和B140處理的Shannon多樣性指數（H）和Simpson多樣性指數（D）顯著高于B0和B60處理；McIntosh多樣性指數（U）表現為 B100＞B140＞B60＞B0，其中 B0 顯著低于 B100 和B140；Shannon均一性指數（E）為B140處理顯著低于B0和B60處理。

表3 不同施肥處理下的土壤微生物群落功能多樣性和均勻度指數Tab.3 Diversity and evenness indices of soil microbial communities of different treatments

2.3 生物炭基肥對土壤微生物碳源利用特征的影響

對各處理土壤微生物31種碳源的利用數據進行主成分分析，結果見圖2。B0處理分布在第三象限，B60處理分布在第二象限，B100處理分布在第一象限，B140處理分布在第四象限。在主成分分析中，PC1和PC2分別解釋了49.87%和26.91%的方差，累計達到76.78%。在PC1軸上，B100和B140處理主要分布在正軸方向上，且離散較小，B0和B60處理主要分布在負軸方向上；在PC2軸上，B0和B60處理主要分布在軸的中段位置，B100處理分布在正軸方向上，B140主要分布在負軸方向上。

進一步分析31種碳源在PC1、PC2上的載荷值（表4），載荷值越高表示對應碳源對主成分的影響越顯著。從表4可知，以|r| ＞ 0.5計，對PC1貢獻較大的碳源有21種，主要包括碳水化合物6種，氨基酸5種，羧酸5種，多聚物2種，酚酸1種，胺類2種，其中18個呈正相關，3個呈負相關；對PC2貢獻較大的有8種，主要包括碳水化合物1種，氨基酸2種，羧酸3種，多聚物1種，酚酸1種，其中5個呈正相關，3個呈負相關。

圖2 不同施肥處理下微生物碳源利用的主成分分析Fig. 2 PCA for carbon source utilization of soil microorganisms under different treatments

表4 不同碳源在PC1和PC2上的載荷值（|r| ＜ 0.4的值未顯示）Tab.4 Correlation analysis of different carbon source utilization with PC1 and PC2 (the values of |r| ＜ 0.4 are not shown)

不同施肥處理下，煙草根域土壤微生物對不同類別碳源的利用程度存在一定程度的差異。煙株根域土壤微生物群落對碳水化合物、多聚物和胺類3種碳源的利用強度均表現為B100和B140處理顯著高于B0和B60處理；氨基酸類的利用強度 為 B100＞B140＞B0＞B60， 其 中 B100 和 B140 處理顯著高于B60處理，B0和B60處理間無顯著性差異；羧酸類碳源的利用強度表現為B100處理最高，但各處理間無顯著性差異；酚酸類碳源為B100＞B60＞B140＞B0，其中 B100 處理顯著高于其他處理。表明生物炭基肥的施用增加了土壤微生物對6類碳源的利用強度。

圖3 不同施肥處理下土壤微生物對6類碳源的利用特征Fig. 3 Utilization characteristics of six substrate categories under different treatments

不同施肥處理對6類碳源共31種底物利用情況的熱圖分析結果表明（圖4）。碳水化合物中，各處理土壤微生物對D-半乳糖酸-γ-內脂、N-乙酰-D-葡萄糖胺的利用程度差異較小，而增施生物炭基肥提高了碳水化合物的利用強度，主要是由于β-甲基-D-葡萄糖苷、D-纖維二糖、α-D-乳糖、i-赤蘚糖醇、D-木糖、D-甘露醇和D,L-α-磷酸甘油的利用差異性造成的；氨基酸底物中，L-苯基丙氨酸、L-蘇氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸對施用生物炭基肥處理貢獻較大；B60、B100和B140處理羧酸類的γ-羥基丁酸、丙酮酸甲酯和D-半乳糖醛酸高于不施用生物炭基肥處理B0，而B100處理的衣康酸利用強度大于其他各處理，B140處理的D-葡萄糖胺酸則小于其他處理；多聚物中，生物炭基肥的施用主要是增加了肝糖底物的利用；B100處理對酚酸類的利用較高，主要是由于2-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸造成的；胺類中，B100和B140處理的苯乙胺和腐胺利用強度顯著高于B0和B60處理。

圖4 不同施肥處理下土壤微生物對31種碳源的利用熱圖Fig. 4 Heatmap of 31 carbon substrate utilization under different treatments

3 討論

3.1 生物炭基肥對植煙土壤養分的影響

直接向土壤中輸入有機物是提高有機碳含量的主要途徑之一[30]。生物炭富含碳素，能夠顯著增加土壤中有機碳含量。同時，生物炭中惰性碳所占比例較大，主要是高度濃縮的芳香化合物[1]，在土壤中有很強的生物和非生物穩定性，施入土壤后較多的有機碳得以保存。而生物炭基肥兼具生物炭和有機肥的特點，既有養分緩釋的作用，同時又可以增加土壤中的有效養分[31]。本研究結果顯示，與對照處理相比，增施生物炭基肥顯著提高了土壤有機碳含量，能夠補償土壤由于長期耕作所損失的有機物質，從而改善土壤特性，這與戰秀梅等[32]的研究結論一致。Zhu等[25]研究顯示，增施生物炭后微生物熵呈現降低趨勢，認為是由于增添生物炭后的稀釋效應引起的。本研究結果中，微生物熵僅B60處理顯著低于B140處理，可能是由于生物炭基肥的添加對土壤有機碳和微生物群落組成的改變程度不同。添加生物炭基肥后，各處理土壤礦質氮含量顯著低于對照。Prayogo等[33]研究也表明，生物炭的施用顯著減少了土壤氮礦化量。生物炭對土壤礦化氮的抑制，一方面可能是由于生物炭的物理結構和表面官能團的吸附作用；另一方面生物炭可能改變參與氮循環微生物的生長，進而影響了土壤氮素動態過程。

土壤酶主要來源于微生物，其活性的高低在一定程度上反映了微生物的活性及其在養分循環中的作用。本研究中生物炭基肥不同添加量處理的土壤蔗糖酶和多酚氧化酶活性均有不同程度的提高，但差異沒有達到顯著水平，脲酶活性表現為B140處理顯著高于B0和B100。有研究表明，添加生物炭對土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性均有提高[34-35]。陳心想等[36]研究則顯示，生物炭在短期內對蔗糖酶活性沒有顯著影響。生物炭對土壤酶的影響具有可變性，這可能是受生物炭種類、施用量、老化時間以及土壤類型等的影響。土壤微生物量碳是土壤有機碳中最活躍和最易變化的部分，也是土壤生物肥力的重要指標之一。生物炭基肥的結構及營養特性都有利于土壤微生物量的增加。本研究結果顯示，隨著生物炭基肥用量的增加，MBC和MBN呈現增長趨勢，除了B60外的其他各處理均顯著高于對照，與其他研究結果一致[37-38]。一方面，生物炭基肥中可利用組分能夠直接為微生物生長提供所需的養分[39]；另一方面，生物炭豐富的孔隙結構可以為微生物的棲息提供良好的環境[40]。

3.2 生物炭基肥對植煙土壤微生物功能多樣性的影響

Biolog微平板法是一種廣泛應用的微生物檢驗技術，其通過微生物對不同碳源底物利用的差異性來反映微生物群落代謝能力的不同。AWCD和功能多樣性指數可以在一定程度上反映土壤微生物的活性及多樣性[27]。Gomez等[41]研究表明，向土壤輸入有機物料能夠增加微生物數量和活性。本研究顯示，添加生物炭基肥處理均使AWCD高于對照，表明外源碳的輸入有利于維持土壤微生物的碳源底物利用能力，這與前人研究結果一致[42]。

微生物功能多樣性分析顯示，隨著生物炭基肥施用量的增加，Shannon多樣性指數、Simpson多樣性指數和McIntosh多樣性指數表現為增大趨勢，Shannon均一性指數為減小趨勢。表明生物炭基肥用量不同，微生物物種的數量、優勢物種的優勢度以及物種的多度均有明顯差異。其中B100處理最有利于提高土壤微生物群落功能多樣性。

主成分分析能夠減少變量的數量又不損失太多的信息，準確體現微生物對碳源的利用能力。本研究結果顯示，不同施肥處理土壤在31種碳源構建的主成分分析坐標體系中存在明顯的空間分異，其中B0和B60處理間的差異較小，而B100、B140與B0處理差異顯著，表明生物炭基肥的施用達到一定量時才能引起土壤微生物群落代謝功能的顯著改變。Chan等[43]研究也表明，生物炭增加了土壤微生物群落數量和多樣性。

4 結論

（1）施用生物炭基肥顯著提高了煙田SOC、MBC、MBN的含量，減少了礦質氮含量，對微生物熵影響不大；對土壤脲酶、蔗糖酶和多酚氧化酶活性具有一定的提升作用。

（2）施用生物炭基肥顯著增加了微生物功能多樣性指數和碳源利用能力，降低了均一性指數，隨著施用量的增大，處理間的差異加劇。

（3）綜合考量生物炭基肥對植煙土壤的改良作用和施用成本，在研究區施用量1.5 t·hm-2即可有較好的效果。