兩株根際促生細菌對TMV的生防作用研究

劉笑瑋，秦元霞,2，袁蓮蓮，何青云，楊金廣，申莉莉

1 中國農業科學院煙草研究所，煙草行業病蟲害監測與綜合治理重點開放實驗室，山東省青島市嶗山區科苑經四路11號 266101；2 沈陽農業大學，植物保護學院，遼寧省沈陽市沈河區東陵路120號 110866

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是一種正義、單鏈的RNA病毒，寄主范圍廣泛，能侵染番茄、辣椒、黃瓜等重要作物。前人調查發現，TMV是最具有科學和經濟意義的病毒[1]，其為害煙草造成葉片花葉、植株矮化、生長緩慢等癥狀，嚴重影響煙葉的質量和產量，給生產帶來巨大的經濟損失。在生產中通常采用化學農藥防治病毒，但化學農藥的大量使用也伴隨著許多不良影響，如“3R1P”問題，即農藥殘留(residue)、有害生物抗性(resistance)及再猖獗(resurgence)和環境污染（pollution），如今，“3R1P”效應已成為全世界公認的、亟待解決的難題。與化學防治相比，生物防治具有生產成本低、環境友好、對人畜無害等優點，成為植物病害綠色防控的研究熱點和發展方向[2]。其中，篩選根際促生細菌，利用其對病毒的抑制作用、對寄主的促生作用進行病毒病早期控制，是病毒病生物防治的重要策略之一[3]。

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR) 是指一類附生于植物根際中能夠促進有益微生物的根際定殖，抑制有害微生物的生防微生物[4]。根據定殖于根際的位置，可將PGPR分為胞外促生菌（ePGPR）和胞內促生菌（iPGPR）[5]。研究發現，PGPR主要有促進植物營養吸收、分泌代謝產物間接調節植物生長、抑制土傳病原菌的功能[6]。一方面，PGPR具有固氮[7]、溶磷[8]、釋放鉀[9]、提供鐵元素[10]等活性，直接為植物提供N、P、K、Fe，促進植物營養吸收；另一方面，PGPR能產生生長素、赤霉素、細胞分裂素等激素間接調節植物生長[11]。此外，PGPR對土傳病害具有生物防治功能：（1）PGPR能產生吩嗪、藤黃綠膿菌素、土壤桿菌素等抗生素來抑制病原物的生長[12-13]；（2）PGPR能合成木聚糖、殼聚糖等幾丁質酶[14]，誘導植物產生系統抗性(Induced Systemic Resistance，ISR)，提高植物抗病力；（3）PGPR能產生溶菌酶，溶解真菌細胞壁，促進病原真菌的細胞裂解[15-16]；（4）PGPR在植物根際定殖，占據病原物侵染位點，可減少病原物的侵入機會[17]，也可與病原物進行營養競爭，從而抑制病原物的擴展[18]。

本研究以實驗室篩選到的兩株根際促生菌Sa、Sk為材料，從促進煙草生長、體外鈍化病毒、室內抗病毒防治效果等方面探究其對TMV的抑制作用。試驗結果表明二者均有良好的生防潛力，該研究為TMV的預防提供了新的方法，并為其實際應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：Sa、Sk；供試毒源：TMV和TMV30B侵染性克隆（帶有GFP標記）；供試煙草品種：三生NN煙、本氏煙、普通煙K326；供試培養基：LB液體培養基、LA固體培養基、霍格蘭氏營養液。

1.2 方法

1.2.1 病毒接種液制備

取TMV病葉1 g，于液氮中充分研磨，加少量0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.0）后，用雙層紗布過濾除去殘渣，加PBS緩沖液定容至40 mL，即為TMV接種液。

將實驗室貯存的含有TMV30B侵染性克隆的農桿菌活化、離心，以MMA緩沖液（10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，50 μmol/L AS）將菌體重懸，利用紫外分光光度計調節OD600值為0.8，以此重懸液浸潤本氏煙葉片[19]。待植株發病后，取1 g病葉研磨，用PBS緩沖液定容至20 mL，即為TMV30B接種液。

1.2.2 發酵液、發酵上清、粗蛋白及去蛋白上清的制備

將Sa、Sk菌株于LB液體培養基中過夜培養作為種子液，吸取1 mL種子液接種于200 mL的LB中，28 ℃，200 rpm培養48 h為發酵液，10000 rpm離心10 min去菌體作為發酵上清。4 ℃條件下，向發酵上清中緩慢加入硫酸銨至最終度為80%，并不斷輕輕攪拌，待硫酸銨全部溶解后4 ℃靜置過夜。10000 rpm離心20 min，沉淀用10 mL PBS緩沖液溶解后，放入孔徑為500 Da的透析袋中進行透析除去硫酸銨[20]，將透析后的粗蛋白溶液冷凍干燥，最終溶解于20 mL PBS緩沖液中作為粗蛋白溶液。取50 mL離心后的上清液，用孔徑為500 Da的透析袋透析，凍干后用 mL PBS緩沖液溶解作為去蛋白上清。

1.2.3 根際促生細菌Sa、Sk的鑒定

菌落形態觀察：蘸取Sa、Sk菌液于LA平板上劃線，28 ℃倒置培養24 h后，觀察記錄菌落形態，參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行生理生化鑒定[21]，同時結合Biolog微生物自動鑒定系統對Sa、Sk菌株進行分類鑒定[22]。

基因組測序：挑取Sa、Sk單菌落于15 mL的LB中28 ℃過夜培養，提取細菌基因組DNA（Bacteria Genomic DNA Kit，Trans）。采用細菌基因組16S rDNA通用引物27F/1492R，以細菌DNA為模板，配置20 μL反應體系進行PCR擴增。將擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化和測序，將測序結果與GenBank數據庫中已報道的16S rDNA核苷酸序列進行Blastn比對。

1.2.4 促生效果測定

平皿濾紙法萌芽試驗：向9 cm的平皿中加入發酵上清（預先過0.22 μm的過濾器除菌）與去離子水比例為1∶10的混合液3 mL，以去離子水代替發酵上清為對照。鋪一層濾紙，每皿點播約100粒本氏煙種子，每處理設置4皿重復，用封口膜封口后，26 ℃培養6～9 d，統計發芽率并稱量百芽鮮重。

水培法促生試驗：向盛有550 mL霍格蘭氏營養液的培養盒中加入20 mL發酵上清，分別以加入霍格蘭培養液、LB培養基代替發酵上清為對照。取長勢一致的四葉期K326幼苗，以清水洗去根土，插入培養孔中進行培養，每組處理8株幼苗，3次重復。每日添加去離子水10 mL，26 ℃培養14 d后觀察植株根冠生長狀況并稱量單株鮮重。

1.2.5 抑制TMV活性測定

在TMV的枯斑寄主三生NN煙（N. tobacumvar.Sumsun（NN））上，采用半葉法測定對TMV的抑制活性：將細菌發酵液、發酵上清、粗蛋白溶液、去蛋白上清分別與等體積TMV接種液混合，將LB與TMV接種液等量混合液作為發酵液、發酵上清、去蛋白上清的對照處理，PBS緩沖液與TMV接種液等量混合液作為粗蛋白溶液的對照處理。靜置15～20 min后，在三生NN煙葉片的左、右兩側分別摩擦接種對照與實驗組。每株接種3～4片展開葉，每處理4株重復。接種后噴清水去除石英砂、保濕，26 ℃培養，3～4 d后調查枯斑數，按以下公式計算抑制效果。

1.2.6 發酵上清對TMV30B的體外鈍化

采用TMV30B摩擦接種本氏煙的模式觀察體系：取TMV30B接種液與發酵上清等量混合，靜置15～20 min后，摩擦接種本氏煙葉片；以等體積的LB與TMV30B接種液混合為對照。每處理設置4株重復，每株接種5片展開葉。26 ℃培養5～6 d，于紫外燈下觀察記錄初侵染造成的綠色熒光斑點數目。

1.2.7 發酵上清對TMV的室內防效

在TMV的系統侵染寄主栽培煙草K326上進行室內防效實驗。使用Sa、Sk發酵上清噴霧處理5～6葉期K326，間隔24 h，共噴施3次，以噴施清水為陰性對照，噴施6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑1000倍液為陽性對照，末次噴施6 h后摩擦接種TMV。每處理設置25株重復，每株接種上部2片展開葉。接種后14 d調查各處理的發病級別，按下式統計病情指數，計算防治效果。

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 根際促生細菌Sa、Sk的鑒定

在LA平板上，Sa菌落圓形、突起、表面光滑、半透明、有光澤，培養36～48 h后菌落膨脹而破裂坍塌（圖1a），革蘭氏染色試驗顯示Sa為革蘭氏陽性菌。Sk菌落近圓形、突起、半透明，表面光滑且有光澤（圖1b），革蘭氏染色結果為陰性。Sa、Sk菌株的生理生化特征及Biolog鑒定結果分別見表1、表2。

圖1 Sa、Sk單菌落形態Fig.1 Single colony morphology of Sa and Sk

表1 Sa、Sk菌株生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of Sa and Sk

根據上述生理生化特征結果，對照《伯杰細菌鑒定手冊》中關于芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬（Pseudomonas）的描述，Sa符合芽孢桿菌屬的特征，Sk 符合假單胞菌屬的特征。

按照Biolog 操作手冊，用GNⅢ板對兩種菌株進行鑒定，結果表明Sa菌株與巨大芽孢桿菌（B.megaterium）相似度最高，而Sk菌株與針綠假單胞菌（P. chlororaphis ss aurantiaca）的相似度最高。

表2 Biolog 系統對Sa、Sk菌株鑒定結果（48 h）Tab.2 Identification of Sa and Sk by Biolog (48 h)

利用細菌基因組16S rDNA通用引物27F/1492R擴增后，Sa的擴增核苷酸序列大小為1437 bp，Sk的擴增核苷酸序列大小為1394 bp。將測序結果進行Blastn比對后，發現Sa與巨大芽孢桿菌（B.megaterium）的同源性為99%，Sk與假單胞菌（P.protegens）的同源性為99%。16S rDNA序列已上傳至GeneBank，Sa登錄號為MH012178，Sk登錄號為MH012179。

綜合Sa、Sk菌株的菌落形態、生理生化特性、Biolog鑒定結果及16S rDNA的鑒定和比對結果，將Sa和Sk分別暫定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）和假單胞菌屬（Pseudomonassp.）。

2.2 萌芽促生效果

由平皿濾紙法萌芽試驗可以看出，3種處理的種子發芽率均為100%，但與對照相比Sa、Sk兩個處理中種子萌發快，且芽更壯（圖2a）。第9 d統計百芽鮮重發現Sa為0.137 g，Sk為0.138 g，兩處理的百芽鮮重均顯著高于對照處理的0.109 g（圖2b），說明Sa、Sk有促進種子萌發的作用。另外，若按照1∶5比例添加Sa、Sk的發酵上清，則萌芽結果與對照無顯著差異，若按照1∶1比例添加Sa、Sk的發酵上清，則種子不萌發（結果未展示），說明高濃度的發酵上清抑制種子萌發，只有適當濃度的發酵上清才會促進種子萌發。

圖2不同濃度Sa、Sk發酵上清的催芽促生效果Fig.2 Germination and growth promoting effect of different concentrations of Sa and Sk fermentation supernatant

K326幼苗水培14 d，發現經Sa、Sk發酵上清處理的幼苗其莖葉生長和根系發育均優于經LB液體培養基處理及對照的幼苗。Sa處理平均單株鮮重為1.740 g，Sk處理平均單株鮮重為1.767 g，均顯著高于LB處理的平均單株鮮重1.125 g及對照單株平均鮮重0.853 g（圖2c）；且Sa、Sk處理的幼苗根系發育粗壯、側根較多，說明Sa、Sk均有促進幼苗生長的作用。

2.3 抑制TMV活性測定

圖3 Sa、Sk不同成分對TMV的抑制活性Fig.3 Inhibition activity of different components of Sa and Sk on TMV

利用半葉法測定Sa、Sk對TMV的抑制作用，可以看出Sa（圖3a）、Sk（圖3b）不同成分對TMV的抑制效果不同。如表3所示，Sa的發酵液、發酵上清、粗蛋白溶液、去蛋白上清抑制TMV的效果分別為92.5%、88.4%、85.2%、83.1%；Sk的發酵液、發酵上清、粗蛋白溶液、去蛋白上清抑制TMV的效果分別為89.5%、86.9%、88.0%、0%，表明Sa、Sk的發酵產物對TMV均有良好的抑制效果。此外，Sk的去蛋白上清無防效，僅粗蛋白溶液產生良好防效，說明其生防活性物質主要為蛋白類。但是，Sa的粗蛋白溶液和去蛋白上清對TMV均具有良好的抑制作用，為了進一步確定Sa的粗蛋白是否具有抗病毒活性，將其水浴加熱滅活后與TMV接種液混合接種三生NN煙，發現蛋白失活后的粗蛋白溶液抑制TMV的效果降低至36.2±2.3%，說明其蛋白成分也具有抑制TMV的活性，表明Sa的生防活性物質主要包括蛋白和非蛋白兩類。

表3 Sa、Sk不同成分對TMV的抑制效果Tab.3 Inhibition effect of different components of Sa and Sk on TMV

2.4 發酵上清對TMV30B的體外鈍化

圖4 Sa、Sk發酵上清體外鈍化TMV30B的能力Fig.4 Passivated ability of Sa and Sk fermentation supernatant on TMV30B in vitro

用TMV30B接種液與發酵上清的混合液摩擦處理本氏煙葉片，5 d后用紫外燈照射葉片統計接種葉上綠色熒光斑點數量（圖4）。其中LB對照的接種葉上綠色熒光斑點平均數量為8.93，而Sa發酵上清處理為2.20，Sk發酵上清處理為4.07，均顯著低于對照。該試驗結果表明：Sa和Sk均有鈍化TMV30B的作用，且Sa的鈍化效果高于Sk，可以明顯抑制TMV30B的初侵染。

2.5 發酵上清對TMV的室內防效

5～6葉期普通煙K326經3次噴施Sa、Sk發酵上清，寡糖·鏈蛋白1000倍液及清水對照后，接種TMV。結果顯示：接種后7 d，清水對照植株的接種葉均開始表現輕微花葉，發病率為100%；接種后10 d，Sa、Sk發酵上清，寡糖·鏈蛋白處理植株的接種葉開始表現輕微花葉，發病率100%。第14 d，對照植株的所有新葉出現花葉綠島癥狀，經Sa、Sk發酵上清和寡糖·鏈蛋白處理的植株其癥狀較輕，發病級別和病情指數顯著低于清水對照。統計顯示Sa發酵上清對TMV的預防效果為27.71%，與寡糖·鏈蛋白的防效25.54%無顯著差異，但略好于防效為18.55%的Sk發酵上清（表4）。

表4 各處理病情指數及對TMV的防治效果Tab.4 Disease index and control effect on TMV

3 討論與結論

目前已鑒定的PGPR菌株涵蓋芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、黃單胞菌屬、黃桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等多個屬種，其中以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬為主[23]。同時，作為根際促生菌，芽孢桿菌屬和假單胞菌屬也是目前研究最為廣泛的兩個屬。研究發現，芽孢桿菌能夠克服鎳（Ni）脅迫[24]、增加根干重、促進植物生長[25]、提高植物抗氧化酶活性[24]和耐鹽性[26]、增強植物抗病性[27]。假單孢菌能夠克服鹽脅迫[28]、維持植物營養[29]、產生激素和抗菌化合物、提高植物產量[30]、激活植物相關防御基因、增強植物抗病性[31]。目前研究多聚焦于根際促生菌產生的抗菌活性物質對土傳病原真菌或細菌病害的抑制作用上，對病毒抑制作用的報道相對較少。本文中鑒定的菌株Sa、Sk分別屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬。對峙培養發現Sa、Sk均能抑制黑脛病菌生長，抑菌效率為67.5%、56.9%，對青枯病菌沒有抑制作用（結果未展示）。促生和防病試驗顯示Sa和Sk能夠促進煙草生長、鈍化病毒，從而抑制病毒的初侵染。

已有研究表明，芽孢桿菌不僅具有解磷促鉀能力，而且能夠產生細菌素（bacteriocins）、活性蛋白酶類和脂肽類表面活性素（suifactins）、伊枯草菌素（iturins）、豐寧素（fengycins）等，對病原菌表現出抑制作用，目前已應用于微生物肥料和生物防治領域[32]。假單胞菌不僅能分泌藤黃綠菌素（Plt）、吩嗪酸（PCA）、2,4-二乙酰藤黃粉（Phl）、嗜鐵素及幾丁質酶和溶菌酶，抑制多種病原菌，還能夠吸附、結合土壤重金屬，已被商業應用于種子包衣抑菌和環境生物修復領域[33]。此外，粘質沙雷氏菌能分泌小分子物質抑制TMV，解淀粉芽胞桿菌和熒光假單胞菌能分泌胞外蛋白抑制TMV[3,20]。本文的芽孢桿菌Sa的抗病毒活性物質主要包括蛋白和非蛋白兩類，假單胞菌Sk其活性物質主要為蛋白類，目前尚未對活性物質進行鑒定。

有研究表明，真菌與根系之間的互作能改變水稻的基因表達，促進側根的生長并使水稻獲得更豐富的營養。被真菌‘殖民’的植物通過真菌菌絲直接獲得了70%～100%的磷酸鹽，真菌生物肥可能會成為未來生物肥[34]。本文促生試驗發現，適當濃度的Sa、Sk發酵上清能夠促進種子萌發、根系發育和莖葉生長。細菌生物被膜與植物根系之間的互作也必將成為細菌生物肥研究的熱點。開展菌株的根際定殖能力及植物根表細菌生物膜形成與作用機制的研究，有助于推進細菌生防菌肥的開發。

目前生防菌對病毒的抑制作用研究以體外鈍化為主、以促生防病為輔，幾乎沒有治療作用，這也是當前抗病毒劑的共同局限性，生產中應該從苗期開始噴施，以預防性為主。本文體外鈍化試驗表明，菌株發酵上清對TMV具有良好的體外鈍化作用，且能有效抑制TMV30B的初侵染和系統擴展，延緩癥狀發生。可將Sa、Sk發展為生物消毒劑，用于土壤、育苗盤、剪葉機等工具的消毒，鈍化殘存的TMV，減少初侵染源。促生和溫室防效試驗顯示，Sa、Sk均兼具促生和防病作用，也可將其發展為生物抗病毒劑，從苗期開始使用，用于培育壯苗和預防病毒。