煙草鹽脅迫與耐鹽相關基因的研究進展

金伊楠，許自成，張環緯，王發展，陳思昂，熊亞南，魏爍果

河南農業大學煙草學院，河南鄭州農業路63號 450002

鹽脅迫是全球農業生產力的主要制約因素，土壤鹽堿化嚴重影響包括煙草在內的作物品質[1]。鹽堿土壤在我國分布十分廣泛，據不完全統計，現階段我國鹽堿地總面積約36000000hm2，占全國可利用土地面積的4.88%。耕地中鹽堿化面積達到920.90000hm2，占全國耕地面積 6.62%[2]。鹽堿土的物理和化學性質較差，表現為孔隙度小、易板結、透性差，土壤養分利用率下降。煙草作為重要的模式植物和經濟作物，被越來越多地用于耐鹽脅迫的研究。本文對煙草耐鹽脅迫的作用機制及耐鹽相關基因表達的研究進展進行了綜述，以期為煙草的耐鹽脅迫研究及種植布局調整提供參考依據。

1 煙草耐鹽脅迫的作用機制

鹽脅迫是指植株在高鹽度土壤中因高滲透勢的影響而不能正常生長[3]。煙草鹽脅迫可分為兩個方面，一是鹽脅迫造成的離子毒害，如破壞質膜結構、阻礙必須礦質元素吸收等[4]；二是鹽脅迫引發的次生脅迫效應，如氧化脅迫、干旱脅迫等[5]。鹽脅迫抑制植物生長發育，嚴重者導致植株死亡。煙草在長期的自然選擇進化過程中形成了抵御鹽脅迫的方式，主要通過離子平衡、滲透調節和清除活性氧來減輕鹽脅迫造成的傷害。

1.1 離子平衡機制

離子平衡是指當植物受到鹽脅迫時，細胞中的離子平衡被打破，大量的Na+可通過K+通道進入細胞。為抵抗鹽脅迫、維持細胞內離子的平衡狀態，植物會通過激活膜通道蛋白、轉運蛋白來調節離子運輸[6]。常見的轉運蛋白有Na+/H+逆向轉運蛋白、ABC轉運蛋白、鉀離子轉運蛋白等。其中Na+/H+逆向轉運蛋白可利用液泡膜上的H+泵將H+運輸到膜外[7]，促進Na+進行跨膜轉運；ABC轉運蛋白借助水解ATP釋放的能量完成跨膜運輸；鉀離子轉運蛋白通過增加H+泵的活性來驅動對鉀離子的轉運，加大對K+的吸收。植物通過轉運蛋白來調節離子運輸，既控制了細胞滲透壓在正常范圍之內，使水分正常進入細胞；又控制細胞質中鹽離子的濃度，防止濃度過高破壞細胞膜[8]，從而實現離子平衡。

1.2 滲透調節機制

植物細胞受到鹽脅迫時大量失水，為了緩解這一狀況，植物通過主動積累各種有機或無機物質來提高細胞液的濃度，降低滲透勢，維持細胞吸水或保水能力，從而達到緩解鹽脅迫的目的。煙草的滲透調節主要分為無機滲透調節與有機滲透調節，無機滲透調節是指細胞內Na+、K+、Ca2+、Cl-等離子大量積累，使細胞內的滲透勢升高，從而完成滲透調節[9]。有機滲透調節是指植物受到鹽脅迫后自身合成并積累一部分可溶性有機物質，例如脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿、甘油、甘露醇等，來降低鹽脅迫對細胞的損傷。

1.3 清除活性氧機制

鹽脅迫破壞了植物體內活性氧的平衡，使植物細胞內積累大量的活性氧，例如單線態（1O2）、羥自由基（OH-）、過氧化氫（H2O2）等[10]。活性氧使細胞膜脂過氧化，破壞細胞膜的完整性。植物通過清除活性氧的抗氧化系統來緩解鹽脅迫，主要包括酶促清除系統和非酶促清除系統。酶促清除系統中的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶[11]。非酶促清除系統包括谷胱甘肽、多元醇、類黃酮和維生素C（抗壞血酸）等抗氧化劑[12]。

2 煙草耐鹽脅迫的相關基因

2.1 離子轉運相關基因

2.1.1 編碼Na+/H+逆向轉運蛋白基因

Na+/H+逆向轉運蛋白的功能是將Na+排出細胞，或運送到液泡中從而保持細胞質處于低Na+水平，高等植物中的Na+/H+逆向轉運蛋白主要定位于液泡膜和細胞質膜，分別稱為液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白（V型）和質膜 Na+/H+逆向轉運蛋白（P型）[13]。

NHX1可編碼液泡膜 Na+/H+逆向轉運蛋白[14]。1999年Gaxiola首次在擬南芥中克隆了AtNHX1基因[15]，轉入番茄后發現轉化株的Na+/H+逆向轉運蛋白在液泡膜中大量積累，植株的耐鹽能力得到提高[16]。CHEN等[17]將鹽角草SeNHX1基因導入煙草，轉基因煙草的根長增加和K+/Na+比值提高，耐鹽性增強。陳鑫等[18]將堿蓬SsNHX1基因轉入煙草，經NaCl處理后轉基因煙株具有較高的K+/Na+比值、抗氧化酶活性、葉綠素含量和發芽率，表明其抗旱性和耐鹽性明顯增強。

細胞質中的Na+外流還可以通過質膜Na+/H+逆向轉運蛋白完成，SOS1是編碼質膜Na+/H+逆向轉運蛋白的基因，可將細胞質中的Na+維持在無毒水平。ZHOU等[19]利用小麥TaSOS1-974基因轉入煙草，轉基因煙草植株的生長優于對照，鹽脅迫處理后轉基因煙草根中的Na+外流和K+流入速率增大，表明TaSOS1-974可能具有保護質膜免受鹽脅迫產生氧化損傷的作用。目前大多數學者側重于NHX1基因的研究，而對SOS1基因在煙草中的作用研究較少。

2.1.2 編碼K+、Na+轉運蛋白基因

高親和鉀離子轉運體蛋白（HAK）可選擇性地從環境中吸收K+，平衡細胞內的Na+/K+比率，防止Na+含量過高對細胞的毒害[20]。秦利軍等[21]對煙草NtHAK1基因進行研究，表明NaCl處理后轉基因煙株的抗氧化酶活性增加，與K+吸收相關的通道蛋白基因的表達上調，例如TORK1基因。鈉離子轉運蛋白（SKC）可專一運輸Na+，不參與K+等其他陽離子的運輸，在抵抗非生物脅迫中發揮著重要作用。姚新轉等[22]將高粱SbSKC1基因導入煙草，結果顯示NaCl脅迫處理后轉基因煙株的存活率和根長顯著高于對照，SOD、CAT和POD酶活性均有提高，轉基因煙株的耐鹽性得到加強。

2.2 滲透調節相關基因

2.2.1 編碼甜菜堿合成途徑的關鍵酶基因

甜菜堿是植物體內的一種水溶性生物堿，作為一種滲透調節物具有較強親和力。甜菜堿在細胞遭遇滲透脅迫后大量積累，以維持細胞滲透壓。一般植物中甜菜堿的主要合成途徑是以膽堿為底物，經膽堿單加氧酶(CMO)的催化生成甜菜堿醛，再經甜菜堿醛脫氫酶(BADH)的催化最終生成甜菜堿。而煙草沒有與甜菜堿合成相關的酶，不能合成甜菜堿。現階段對甜菜堿的研究較多，并且針對CMO、BADH基因的研究較深入。

WU等[23]將鹽生植物海蓬子CMO基因轉入煙草，轉基因煙株可在鹽脅迫下正常生長，葉綠素含量和甜菜堿積累明顯高于對照，耐鹽性得到提高。LUO等[24]將水稻OsCMO基因導入煙草，發現轉基因煙株甜菜堿含量增加，對鹽脅迫的耐受性提高。

Rathinasabapathi等早在1994年將菠菜及甜菜的BADH基因導入煙草，轉基因植株在NaCl脅迫下可正常生長[25]。有研究表明[26]，在煙草中表達矮沙冬青AnBADH基因，轉基因煙苗在NaCl脅迫下可正常生長，鹽脅迫處理后轉基因植株的甜菜堿含量升高，可溶性糖含量、游離脯氨酸含量顯著增加，轉AnBADH基因煙株的耐鹽性明顯增強。

2.2.2 編碼脯氨酸合成途徑的關鍵酶基因

脯氨酸是植物細胞應對非生物脅迫產生的一種低分子量、高水溶性的小分子有機化合物。在鹽脅迫條件下，植物組織積累脯氨酸，從而減輕過量氨對機體的毒害作用、清除自由基以保護質膜的完整性、調節滲透壓來防止質膜透性的變化。

脯氨酸合成途徑之一是以谷氨酸（Glu）為底物，經吡咯啉 -5- 羧酸合成酶（P5CS）和吡咯啉 -5- 羧酸還原酶（P5CR）等酶的催化最終生成脯氨酸[27]（圖1），該途徑主要在細胞質和葉綠體中進行[28]。早在1995年，Kishor等就將P5CS編碼基因導入煙草，轉基因煙株中脯氨酸含量明顯增加，其耐鹽性遠高于對照組[29]。

脯氨酸的合成底物谷氨酸主要來源于谷氨酰胺合成酶—谷氨酸合成酶（GS-GOGAT），植物谷氨酰胺合成酶有許多同工酶，可分為胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和質體型谷氨酰胺合成酶（GS2）[30]。賈喜婷等[31]研究認為過表達TaGS1/TaGS2可增加煙草在鹽脅迫后的脯氨酸含量，提高氮素利用率和耐鹽能力。Luca等[32]研究表明過表達柑橘CsGSTs基因的煙草植株表現出對鹽脅迫耐受性。

圖1 植物脯氨酸合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of proline in plants

2.2.3 編碼海藻糖合成途徑的關鍵酶基因

可溶性糖，如海藻糖具有滲透調節作用，海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）是參與海藻糖合成過程中的關鍵酶。郭蓓等[33]將擬南芥AtTPS基因導入煙草，發現轉基因煙草植株的海藻糖含量增加，鹽脅迫耐受性得到增強。

2.3 抗氧化性相關的酶基因

2.3.1 超氧化物歧化酶

煙草遭受逆境脅迫時，煙株體內聚集大量的活性氧（ROS）。近年來，研究人員采用基因工程的手段表達ROS清除因子來提高煙草的抗鹽性。超氧化物歧化酶（SOD）有多種類型，例如CuZnSOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD等，在煙草中研究較多的是CuZnSOD。

CuZnSOD是定位于細胞質和葉綠體中的超氧化物歧化酶，Negi等[34]將從耐鹽花生細胞系中分離的AhCuZnSOD基因導入煙草，轉基因煙株的AhCuZnSOD基因在干旱、高鹽、寒冷和氧化脅迫等多種非生物脅迫下轉錄上調，使SOD酶活性增加，從而改善了非生物脅迫下的氧化損傷。JING等[35]將秋茄中編碼CuZnSOD的KcCSD基因導入煙草，轉基因煙草SOD酶活性增強，通過排除根中的Na+提高了煙株的耐鹽性。

2.3.2 抗壞血酸過氧化物酶

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是一種具有抗氧化作用的物質，可有效清除細胞內的ROS，主要通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環系統（AsA-GSH）完成，該系統通過抗壞血酸過氧化物酶和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）等的作用維持抗壞血酸和谷胱甘肽氧化還原狀態的平衡[36]。

研究表明[37]，將番茄LetAPX基因轉入煙草，轉基因煙株的APX酶活性明顯提高，煙草種子發芽率增加，對鹽脅迫的耐受性增強。LIU等[38]將麻瘋樹JctAPX基因轉入煙草，轉基因植株耐鹽性增加，葉綠素含量和APX酶活性增強。Singh等[39]發現轉海蓬子SbpAPX基因煙草的耐鹽性和對干旱脅迫的耐受性得到提高。

DHAR在鹽脅迫時能清除細胞中過量的活性氧，增強植株對非生物脅迫的抗性。吳茜等[40]將擬南芥DHAR基因導入煙草，轉基因植株表現較強的耐鹽能力，其地上部分生物量、葉綠素含量和光合速率都顯著高于對照。

2.3.3 過氧化物氧化還原酶

過氧化物氧化還原酶（Prxs）是存在于生物體內的一類抗氧化酶系[41]。2-Cys Prx具有清除葉綠體內ROS的能力，將該基因轉入煙草中可提高SOD酶活性，抑制APX酶活性，在高鹽環境下增強光合電子傳遞鏈的穩定性，降低PSII的光抑制程度[42]。

2.4 信號傳導與表達調控相關基因

2.4.1 ERF類轉錄因子

轉錄因子在植物非生物脅迫中起至關重要的作用，主要參與信號傳導。乙烯反應因子（ERF）是一類數量較多的植物特異性轉錄因子家族。

研究表明，將ERF類轉錄因子W6基因導入煙草，鹽脅迫下的轉化煙株SOD 酶活性和葉綠素含量較對照增加[43]。YANG等[44]將麻瘋樹中JcERF1基因導入煙草，能夠增強煙草的耐鹽性，并發現JcERF1蛋白的靶向在細胞核。WANG等[45]在麻瘋樹中發現JcERF2基因，轉入煙草發現過表達JcERF2基因的煙株游離脯氨酸含量和可溶性糖的含量增加，H2O2含量降低，這些結果暗示轉JcERF2基因的煙草耐鹽性提高。張朝等[46]將ERF類轉錄因子TaW基因導入煙草，發現葉片的葉綠素含量增加，且生長情況優于對照，TaW基因的過表達提高了煙草的耐鹽性。WU等[47]發現轉枸杞LchERF基因煙草的耐鹽性提高。YAO等[48]將楊樹ERF76基因導入煙草中，鹽脅迫下轉基因煙草的種子發芽率、根長、鮮重、SOD、POD酶活性和脯氨酸含量增加，煙草耐鹽性得到提高。

2.4.2 DREB類轉錄因子

脫水響應元件結合蛋白（DREB）類轉錄因子屬于AP2 / ERF基因家族，廣泛參與植物應激反應途徑，其抵御非生物脅迫的功能已在多種植物中得到鑒定[49]。

李彥幫等[50]對轉二色補血草LbDREB基因的煙草進行研究，表明轉基因煙株SOD酶活性和K+/Na+比值提高，LbDREB基因調節過氧化物酶基因（POD）和脂質轉移蛋白基因（LTP）的表達，轉基因煙草的耐鹽性提高。WEN等[51]從柳枝稷中克隆DREB基因轉入煙草，鑒定出4種冷誘導型PvDREB1，其中PvDREB1C是對冷脅迫響應最快的基因型。在鹽脅迫下，轉PvDREB1C基因的植株葉片K+/Na+比值和Ca2+含量增加，耐鹽性提高，推測該基因可能與細胞滲透勢增加有關。趙清等[52]研究表明，轉擬南芥DREB2A基因煙草對鹽脅迫的耐受性提高。ZHANG等[53]將多汁堿蓬SsDREB基因導入煙草，過表達SsDREB的煙株對鹽和干旱脅迫的耐受性得到增強。

2.4.3 WRKY類轉錄因子

WRKY類轉錄因子是植物當中一類比較大的轉錄因子家族。這類轉錄因子的蛋白包括一個或兩個保守的WRKYGQK 序列（由此而命名為 WRKY）。WRKY類轉錄因子是在植物中發現的N-端含有高度保守氨基酸序列的新型轉錄調控因子，可與TGAC序列發生特異性作用，調節啟動子中含有W-box元件的調節基因和功能基因的表達，可在非生物脅迫中發揮重要的作用[54]。

LI等[55]發現在煙草中過表達番茄SpWRKY1可提高對煙草黑脛病的抗性，轉基因煙草植株對鹽和干旱脅迫的耐受性也得到增加。LIU等[56]從棉花中克隆獲得GhWRKY25，發現轉化GhWRKY25基因降低了轉基因煙株的耐旱性，但可增強煙株的耐鹽性。WANG等[57]從小麥中分離出TaWRKY44基因，轉TaWRKY44基因煙草植株具有較高的SOD、CAT和POD酶活性，從而增強了耐鹽性。

2.4.4 鋅指蛋白類轉錄因子

鋅指蛋白是一類數量較大的轉錄因子家族，主要通過與Zn2+結合維持一種可自我形成“指狀”結構的結構域，參與調控基因的表達[58]。鋅指蛋白類轉錄因子可分為C2H2、C2C2、C2HC等，其中C2H2型是真核生物基因組中數量最多的鋅指蛋白[59]。

于瑞等[60]對過表達秋茄KcZFP的轉基因煙草進行研究，發現該基因屬于C2H2型，對光合系統有一定的保護作用，轉基因煙株的脯氨酸含量高于對照，提高了煙草的耐鹽性。ZPT2是具有兩個鋅指結構域的C2H2型鋅指蛋白轉錄因子，Dechun等將枸橘PtrZPT2-1導入煙草中，轉基因煙株中滲透調節溶質增加和H2O2減少，從而增強了煙株的抗寒、抗旱和耐鹽性[61]。

SAP是涉及脅迫應答與調控的鋅指蛋白，水稻OsSAP1是植物中第一個被報道的AN1/A20 型鋅指蛋白，該基因可提高轉基因煙草對低溫、干旱和鹽脅迫的耐受能力[62]。丁林云等向煙草中轉入棉花GhSAP1基因，轉基因煙草的葉綠素和可溶性總糖含量增加，SOD酶活性提高，K+/Na+比值處于平衡水平，從而使耐鹽性增強[63]。

2.4.5 鈣依賴蛋白激酶合成相關基因

鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）在鈣信號傳遞到下游效應中發揮了重要作用。康樂等[64]發現，鹽脅迫后普通煙草NtCDPK15基因在莖中表達量顯著上調；在葉中可實現誘導表達；在根中的表達則不受影響。Vivek等[65]從生姜產生的應激cDNA中分離到ZoCDPK1基因，發現ZoCDPK1基因可增加煙草的耐鹽性，ZoCDPK1在煙草中的表達水平上調與脅迫相關的RD21A和ERD1基因有關。總的看來，目前關于煙草中CDPK蛋白基因的報道較少。

2.4.6 油菜素甾醇合成的關鍵酶基因

油菜素甾醇（BRs）是一種新型的植物生長調節物質。CPD基因編碼甾醇類23a羥化酶，是油菜素甾醇合成途徑中的關鍵酶。陳永富等[66]將胡楊PeCPD基因導入煙草，轉基因煙株的鮮重是對照的一倍多，且葉綠素含量、SOD和POD酶活性提高，研究結果暗示PeCPD基因在提高煙草耐鹽性中發揮著重要作用。CYP85A1基因編碼催化BRs生物合成的關鍵酶[67]，過量表達菠菜SoCYP85A1基因可增強煙草的耐鹽性[68]。

2.5 保護細胞免受脅迫傷害的相關功能蛋白基因

植物體內存在大量編碼功能蛋白的基因，可對逆境脅迫產生不同的響應。高鹽條件下，LEA蛋白能維持細胞結構的穩定性[69]。趙微等[70]從大麥中獲得了編碼LEA家族HVA蛋白的基因HVA1，將其轉入煙草后發現，外源HVA1基因有助于煙草種子在鹽脅迫下的萌發，增加耐鹽性。

擴展蛋白是通過介導細胞壁擴張來調節植物生長發育和非生物脅迫耐受性的細胞壁蛋白。CHEN等[71]將小麥膨脹素基因TaEXPA2轉入煙草中，發現轉TaEXPA2的煙株對鹽脅迫的耐受性提高，并且發芽率和存活率上升；過表達TaEXPA2基因提高了煙草的耐鹽性，這可能與水分狀態的改善、Na+/K+的動態平衡和抗氧化能力相關。

3 展望

鹽脅迫已成為非生物脅迫中的重點研究領域，煙草作為重要的模式植物也得到了越來越多的關注。近年來，大部分對煙草鹽脅迫的研究都是通過基因工程進行的，因此，以下問題值得進一步思考：

（1）現階段基因工程已經成為煙草耐鹽性研究的重要方法，大部分研究僅涉及將外源基因導入煙草并進行功能驗證，尚未涉及基因敲除技術，以及抗鹽脅迫突變體等方面的研究。

（2）關于煙草耐鹽相關基因的研究，大多集中在其它植物耐鹽基因在煙草中的應用研究，針對煙草自身耐鹽基因的研究則相對較少。

（3）對轉基因煙草耐鹽性機制的研究還不夠具體深入，尚未明確哪個反應過程對抵御鹽脅迫是有幫助的。

（4）已有少量研究將雙基因導入到煙草中，但基因間是否存在交互作作用，以及對轉雙基因植株的功能研究還不夠深入。

（5）大部分關于煙草鹽脅迫的研究都是將煙草作為一種媒介，而對改良煙草品質的應用研究較少，同時，有關煙草鹽脅迫的研究尚未有效地服務于生產實踐。因此，關于煙草耐鹽脅迫的相關研究尚需進一步深入。