煙草野火病菌的基因組學分析及其致病性分化研究進展

蔡訓輝，王如意，范彥君，陳燾，周瑋

1 湖南農業大學植物保護學院植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128；

2 湖南省農業大數據分析與決策工程技術研究中心，長沙 410128；

3 湖南農業大學湖南省生物農藥與制劑加工工程技術研究中心，長沙 410128；

4 湖南農業大學農學院，長沙 410128

煙草野火病(tobacco wildfire disease)是一種細菌性病害，是煙草葉部主要病害之一，在世界范圍內均有發生，能夠通過雨水傳播，具有爆發性和毀滅性。煙草野火病于1917年由美國人Wolf和Foser首次報道，4年后在美國弗吉尼亞州爆發，造成煙葉減產1000萬公斤，之后在世界各產煙國相繼發生，對世界范圍內煙草的生產造成了巨大的影響[1]。我國云南煙區早在上世紀40年代末有該病零星發生的記載，由于其危害一直較輕，被視為煙草生產上的次要病害。直到上世紀80年代，煙草野火病在我國14個省份均有不同程度的發生，且在東北三省、云南等重要產煙地區連年發生，危害嚴重，成為我國煙草生產上的主要病害之一[2]。隨著高通量測序技術和大數據分析方法日益成熟，越來越多的野火病致病菌株已完成全基因組序列測定，有助于研究人員深入了解野火病發生過程。本文就已完成測序的煙草野火病菌基因組與其他假單胞桿菌屬菌株的基因組特征進行了比較，總結了當前野火病菌致病機制及生理小種(Physioloigical race)相關研究，以期為野火病的分子機理研究和防治提供幫助。

1 煙草野火病的基因組學研究

1.1 丁香假單胞菌屬基因組

丁香假單胞菌屬(Pseudomonas syringae, PS)是研究植物-微生物相互作用的重要植物致病性細菌，能通過植物葉片、莖、果實上的傷口或氣孔等通道進入到植物細胞的非原生質區域。根據寄主的不同以及誘導病害癥狀的差異，目前已經發現了60種PS致病小種，每個PS致病小種都有其特定的寄主范圍[3]?？紤]到丁香假單胞菌菜豆致病變種(Pseudomonas syringaepv.phaseolicola, Pph1448A)[4]、丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringaepv.syringae, PsyB728a)[5]和丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringaepv.tomato, PtoDC3000)[6]作為PS研究領域的模板基因組序列被廣泛用于測序和比較分析，故本文重點選擇美國國立生物技術信息中 心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)公布的包括其在內的5個丁香假單胞致病菌染色體組【其他2個為煙草致病變種Pseudomonas syringaepv.tabaci（Pta11528 和Ptayuexi-1）[7-8]】 和3個PS的8個不同質粒（其中包括6個丁香致病變種質粒基因組、1個咖啡致病變種質粒基因組和1個煙草致病變種質?；蚪M[9]）基因組進行分析和綜述。染色體基因組特征詳情見表1。

表1 5個丁香假單胞菌屬菌株染色體基因組主要特征Tab.1 Main characteristics of genome sequenced in 5 Pseudomonas syringae strains

上述PS致病菌的染色體基因組中最大的是番茄致病變種(6397126 bp)，最小的是菜豆致病變種(5928787 bp)，但整體相差不大；核基因組的GC含量均在57.96%～59.23%之間；編碼序列比例都在85.9%～88.5%之間；雖然不同致病變種之間核基因組相差不大，但基因數目差異比較懸殊，最多的Ptayuexi-1中含有5701個基因，最少的PsyB728a只有5137個基因，且Pta11528中有303個基因序列與其他3個丁香假單胞菌基因組序列(Pph1448A、PsyB728a和PtoDC3000)之間沒有顯著同源性[7]；同是煙草致病變種，RNA基因數目相差很大，Ptayuexi-1菌株含有84個RNA基因，而Pta11528只含有68個RNA基因，且它們都含有3種rRNA(5S、16S和23S)編碼基因；核苷酸序列同源性比較發現，Pph1448A與Pta11528的基因組序列最相似，同源性高達97.02%，而PtoDC3000與Pta11528序列的同源性只有87.65%，Pta11528中與其他3個假單胞菌不具同源性的基因組區域將是研究其致病性和菌株特異性的關鍵[7]。目前，還有數個其他PS的致病菌已完成全基因組測序，并在GenBank上公布序列，為從全基因組水平上研究PS的流行機制以及與寄主的互作機制、侵染部位、作用毒素等問題提供方便[10-12]。

現有研究除了對PS染色體基因組序列做了深入挖掘外，還對其質?；蚪M序列信息進行了深入探討，主要特征詳情如表2所示，這些全長閉合環狀質粒序列長度大小均在61606 bp(UMAF0081)～73842 bp(Ppt0893-29)之間；GC含量均在53.47%(Ppg2708)～56.01%(Ppt0893-29)之間；不同質粒中開放式閱讀框的數目在65～83個之間，且不同質粒間的假定蛋白的占比在32.5%～37.3%之間?；谛蛄行盘栯?、跨膜結構域和氨基酸序列的生物信息學功能預測結果表明，Pta0893-29和Pga2708中各有3個假定蛋白可能為Ⅲ型分泌系統(Type Ⅲ secretion system, T3SS)效應蛋白，Psy0170和Psy7B44中各有1個[9]。

表2 丁香假單胞屬菌株質?；蚪M的主要特征Tab.2 Main characteristics of plasmids sequenced in Pseudomonas syringae

續表2

1.2 丁香假單胞菌屬的T3SS系統及其毒力研究

PS細菌的毒力和致病性主要取決于其本身含有的T3SS。適當的環境因素能激活T3SS編碼基因的表達，從而啟動結合在雙層細胞膜上的巨大針狀復合物的組裝以及各種效應蛋白的分泌。病原菌通過T3SS向寄主植物細胞質中分泌一系列效應蛋白分子以擾亂植物自身的生理代謝過程，同時抵抗植物激活的防御響應相關過程，最終致病，甚至裂解細胞。根據效應物被發現時的表型，Hrp(hypersensitive response and pathogenicity)效應蛋白通常被稱為Hrp外分泌蛋白(Hrp outer protein, Hop)或無毒蛋白(avirulence,Avr)，目前已知的丁香假單胞菌有30余種效應蛋白通過T3SS輸送至寄主植物細胞體內[13]，PtoDC3000菌株中發現有31種效應蛋白，PssB728a菌株中只有27種效應蛋白，且其中5種不在PtoDC3000中[5]。Hrp效應蛋白在丁香假單胞菌屬中較為保守，其絕大部分也出現在Pta11528（23種）中，包括AvrE1、HopAH2、HopAJ2、HopAK1、HopAN1、HopI、HopJ1、HopX1、HrpK1和HrpW1，還包括HopO1、HopT1、HopAH1、HopR1、HopV1、HopAG1、HopAS1、HopAE1、HopAR1、HopF1、HopW1、HopAI1'的親密同系物和一個退化的HopM1'[7]。相關研究表明效應蛋白的分泌對T3SS有依賴性，且T3SS對寄主也有依賴性，因此缺少T3SS的PS細菌突變體不能成功侵染寄主植物并引起相應病害[14]，這為野火病防治提供一條重要途徑。深入研究這些分泌效應蛋白，明確它們在寄主體內的修飾相關信號轉導途徑，以及抵抗寄主活化防御的級聯反應進程，將對煙草野火病的發生與防治起深遠意義。

除了T3SS效應蛋白外，PS病菌的致病性還受多種因素的影響，包括植物毒素、生物膜、植物激素、細胞外多糖(Extracellular polysaccharide, EPS)和細胞壁降解酶等[15]。PS是一個產生毒素很普遍、毒素研究很廣泛的一個屬，其產生的毒素主要有冠毒素(Coronatine)、菜豆毒素(Phaseolotoxin)、丁香毒素(Syringomyxin)、萬壽菊毒素(Tagetitoxin)以及煙毒素(Tabtoxin)等，這些毒素的作用機理包括破壞細胞膜的通透性、物理作用、抑制酶的活性等。進一步研究還發現細菌鞭毛、趨化性和對鐵元素的吸收將影響它們的運動和獲取營養的能力，進而對致病菌的毒力產生重要影響[16-17]。此外，其他分泌系統和脂肪酶等對病原毒力也有重要作用[18-19]。

1.3 丁香假單胞菌屬的致病島

致病島(Pathogenicity island, PAI)是指位于細菌染色體上編碼細菌毒力基因比較集中的某些特定區域，通常是相對分子質量比較大的DNA片段。致病島通常攜帶多個毒力基因，它能編碼黏附因子、毒素、透明質酸酶、蛋白分泌系統、鐵攝取系統、侵襲因子、信息傳導系統、調節系統等。丁香假單胞菌在宿主中引起疾病并在非寄主植物中引起過敏反應(Hypersensitive response, HR)的能力受hrp基因的控制，該基因也被稱為hrpPAI[20]。丁香假單胞菌hrpPAI序列由一個基因簇和位于它兩側的交換效應基因座(Exchangeable effector locus, EEL)、保守效應基因座(Conserved effector locus, CEL)組成，該基因簇負責編碼T3SS裝置。序列比對發現，一套核心的hop基因位于hrpPAI上，且在Pta11528和Pph1448A菌株中都高度保守，在菌株Pta11528中除了hrpZ1基因存在缺失和hrpV-hrcU基因間區有插入外，核心hop基 因avrE1、hopAH2、hopAJ2、hopAK1、hopAN1、hopI1、hopJ1、hopX1和hrpK1都高度保守，并編碼完整的全長蛋白。Pta11528還編碼一個全長的HrpW1蛋白，但相對于Pph1448A序列，中間有兩個短片段（69 bp和12 bp）的插入。Pta11528菌株hrpPAI區段與其他幾個菌株序列（1448A、B728a和DC3000）最大的區別在于hrpZ1基因中有一個很大的缺失（可能使其失去功能），hopAF1基因完全缺失，而hopAF1在其他致病菌株中是保守的，hrpZ1在大多數丁香假單胞菌中也是保守的；Pta11528中還包含3個其特有的hop基因(hopAR1, hopF1, hopW1)，在其他菌株中都不存在相應的同源基因[7]。

hrpPAI根據功能可以分為調節系統、T3SS和T3SS基質3類[21]。hrpPAI編碼的T3SS及其調節系統是煙草野火病發生所必需的。同時，3種細胞內調節蛋白HrpR、HrpS和HrpL是hrpPAI基因表達的重要催化劑。HrpR和HrpS是屬于NtrC家族的兩種操縱子，在結構上與增強子結合蛋白有關，但其缺少受體結構域并且不需要同源蛋白激酶激活，它們通過相互作用正向調節hrpL基因啟動子，HrpL是屬于胞外因子(Extracytoplasmic factor, ECF)家族的一種RNA聚合酶σ因子，識別基因上游區域中的共有基序(hrpbox)來誘導hrp基因的表達[22]。通過對Pta11528序列進行基因功能篩選，還發現hopO1、hopT1、hopAH1、hopAE1、hopAR1、hopM1'和hopAI1'基 因是其毒力相關的HrpL正調節子的一部分[7]。

1.4 基因水平轉移與病原菌寄主適應性進化

基因水平轉移(Horizontal gene transfer, HGT)在原核生物和單細胞真核生物中發生頻繁，是二者進化的重要動力。丁香假單胞菌質粒含有許多致病基因，且具有跨菌株水平轉移的潛力，是毒力進化的決定因素，研究者發現菜豆和獼猴桃之間的致病性轉移可能與Pan獲得Pph1448a菌株中的質粒（該質粒含有許多毒力基因以及菜豆毒素合成相關基因）有關[11]。目前煙草致病變種的質粒水平轉移未見相關報道。

病原菌通過毒性基因影響寄主的生活力、繁殖力、生存力、子代的生命力來施加其選擇性壓力，從而改變寄主種群的基因組成和演化趨勢；反之，寄主通過其抗性基因行使對病原菌的選擇性價值，這就是自然環境中植物與病原菌的共進化[23]。從黃瓜中分離出來的Pla106菌株，它的三型效應子(Type Ⅲ effector, TTE)套件大部分與兩種番茄病原體相同，從而推斷番茄和黃瓜致病菌間可能通過進化實現宿主的轉移[11]。PS的T3SS裝置由大約20～25種不同的蛋白質組成，其中約有一半的蛋白在大多數PS中是保守的，這些保守的蛋白與細菌鞭毛基體部分的蛋白質序列相似，且鞭毛系統和三型分泌系統有共同的分泌蛋白，可能原因是T3SS在進化的過程中復制了鞭毛的某些基因，這表明細菌鞭毛和T3SS之間存在共同進化的歷史[24]。宿主范圍內緊密相關的致病菌間有顯著差異，造成這些差異的原因在分子、遺傳和進化基礎上仍不清楚。

2 煙草野火病的病理生理學研究

2.1 丁香假單胞菌煙草致病變種

Pta是一種兼性營養型煙草野火病致病菌[25]，其寄主范圍十分廣泛，能侵染二十多個屬的植物，包括煙草、茄子、辣椒、黃瓜等，在宿主煙草植物中引起野火病害，在其他非宿主植物中誘導HR，所以普遍認為它的真正寄主是煙草屬的植物[26]。煙草野火病和角斑病經常混合發生，且其病原在細菌學形態上有很多相似性，區分具有一定難度。它們最主要的區別在于野火病菌可以產生野火毒素，使得病斑周圍出現明顯的褪綠黃色暈圈，經連續培養后野火病菌會變異成產毒較弱或不產毒素的菌株，接種后病斑周圍黃色暈圈較弱或不產生黃色暈圈，而角斑病菌不能產生野火毒素，所以病斑周圍無黃色暈圈[27]。比較2種細菌的致病性發現：它們在煙葉中的生長速度和生長量不同；植株年齡和煙葉位置對病原的敏感也有不同，野火病易侵染幼株(42 d)的下部葉片，而角斑病菌易侵染旺長后期的中部和上部葉片[28]。有些學者認為它們是2種不同的病菌，但更多的學者認為是同一種病菌。

2.2 煙草野火病菌的致病機制和病理生理學

煙草植株在感染野火病之后，野火病原菌分泌出一種特殊的煙毒素(tabtoxin)二肽，結構式為α-乳酸氨基-β-羥基-ε-氨基庚二酸內酯，煙毒素在細胞液中合成，轉移到周質中，最終被氨肽酶水解成煙毒因 -β-內酰胺 (tabtoxinine-β-lactam, TβL)，并同時釋放出絲氨酸或蘇氨酸[29]。谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)是植物細胞內甘氨酸轉移為絲氨酸，釋放氨的光呼吸再循環過程中的生物催化劑，而TβL是GS的不可逆抑制劑，因此GS活性被抑制導致了氨的大量積累，從而使煙草中毒[30]。氨的快速聚集還會破壞細胞當中的葉綠體結構和功能，導致葉片上褪綠暈圈和枯斑的形成，即便是在正常的光照條件下，仍然會形成褪綠的小斑點[31]。通過序列比對，研究人員揭示了PtaBR2中TβL的生物合成基因簇（表3），該基因簇由12個基因組成，功能分析發現基因產物TabC含有一些與鋅結合蛋白同源的基序；TblA與甲基化酶有弱相似性，推定可能是煙毒素生物合成酶；TabA與二氨庚二酸脫羧酶(LysA)具有高度相似性；TabB與琥珀酰二氨基庚二酸氨基轉移酶(DapD)高度相似；TabD是一種類Aat轉氨酶；TabP是一種鋅金屬肽酶，推定可能負責把煙毒素轉化為毒性形式的TβL[32]。Studholme等[7]通過基因功能篩選同樣發現了Pta11528中一段長16.6 kb的序列片段為煙毒素的生物合成基因簇。另外，熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)與TβL的活動密切相關，HSP70在TβL引起煙株細胞死亡的過程中發揮重要作用[33]。NbAC（Nicotiana benthamiana adenylyl cyclase，煙草腺苷酸環化酶）能正向調節TβL介導的與細胞死亡有關的宿主信號級聯反應，這些都是野火病菌在短時間內誘導煙株發病的重要因素[34]。

表3 PtaBR2煙毒素生物合成基因鑒定Tab.3 Tabtoxin biosynthetic genes identified from Pseudomonas syringae pv. tabaci BR2

研究還發現野火毒素能夠干擾煙草細胞的代謝，使煙草葉片內葉綠素合成受阻，同時煙毒素還干擾寄主組織的RNA代謝及膜的谷氨酸代謝，導致煙草幼苗發育不良甚至誘導煙草葉片發生程序化細胞死亡(Programmed cell death, PCD)[35-37]。野火病菌的代謝產物還可以誘導煙草葉片氣孔關閉[38]。

2.3 野火病菌的生理小種及致病性分化

國外研究者以長花煙(Nicotianal longifloraL.)和黃花煙(Nicotianal rusticaL.)作為鑒別寄主，把煙草野火病菌分為0、1、2和3共四個生理小種[39-42]。0號生理小種能侵染原始烤煙品種，但不能侵染長花煙；1號生理小種能夠突破長花煙抗性但不能侵染黃花煙；2號生理小種則能侵染目前所有煙草；3號生理小種能克服黃花煙來源抗性卻不能侵染長花煙來源抗性的煙草。而在我國，只有云南、黑龍江、吉林3省對自己煙區內的野火病生理小種進行了劃分，其它煙草野火病爆發地區未見對野火病菌鑒別寄主體系及生理小種分化進行報道。彭潤等[43]對云南省煙草野火病菌生理小種進行了相關研究，從云南省主要產煙區收集了45個煙草野火病菌菌株，以黃花煙、長花煙、云煙85和K326作為鑒別寄主，以發病率作為指標，將供試菌株劃分為4個生理小種（即生理小種Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。陳赟娟等[44]對采自云南省各大煙區的24個煙草野火病菌進行分化研究，以長花煙、黃花煙、G28和云煙85作為鑒別寄主，以暈圈直徑平均值作為評價指標，將24個病原菌株劃分為2個生理小種，即0號和1號。孫劍萍等[45]采用針刺接種法，將黑龍江省主要煙區采集的15個煙草野火病菌株接種到28個供試煙草品種上，通過對發病率的差異性分析和聚類分析來測定供試煙草品種的抗性表現，最終將15個供試菌株劃分為4個生理小種（即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。隋原[46]對來自吉林、黑龍江兩省主要產煙區的61個野火病菌菌株進行了菌株致病性研究，發現不同來源的菌株侵染煙草不同品種的潛育期、病斑大小、單株病斑數和病情指數存在一定差異，來自吉林地區的菌株致病性相對比較強，進一步對61個菌株的DNA進行聚類發現，親緣關系的遠近與致病性之間無明顯相關性。綜上研究可以看出，我國不同煙區的煙草野火病菌株的生理小種劃分和菌株致病性研究存在一定差異。

3 展望

丁香假單胞菌煙草致病變種的研究已經持續了多年，積累了大量理論知識，但還是有很多問題有待進一步探討：

（1）雖然測序分析證明在野火病菌致病的過程中Pta效應蛋白的泌出對T3SS具有依賴性，但大部分效應蛋白的功能以及它們在寄主體內的攻擊目標仍然未知；

（2）野火病致病菌T3SS的蛋白輸送機制有待進一步明確；

（3）野火病病原編碼致病性因子相關的DNA片段或區域仍需進一步明確；

（4）我國各主要產煙區的野火病生理小種的分布及其致病性分化需要進一步明確；

（5）進一步明確野生煙草資源（主要是長花煙草和黃花煙草）中蘊藏著的野火病抗性基因，開展品種的抗野火病定向改良，通過生物技術手段鑒定克隆這些基因，并將其導入烤煙品種中，進而提高烤煙品種對野火病的抗性，這對煙草野火病防治工作具有重要現實意義。

相信隨著高通量測序技術的普及，未來還會有更多的野火病菌株基因組被測序，這將大大豐富Pta的基因組信息和該物種的泛基因組，同時運用更高效的生物信息學分析方法，全面深入地探討每一個基因功能，為野火病菌的入侵、與寄主互作、病害發生、共進化過程等研究提供堅實理論基礎，為野火病的防治提供理論指導。