紫莖澤蘭提取物對煙草疫霉菌的抑制作用研究

戴美玲，李強(qiáng)，解燕，毛建書，王津軍，譚軍，張一揚(yáng)，高華峰，閆晨兵，張瑞勤，劉加紅，張堅(jiān)，譚琛，游旭東，周冀衡

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)學(xué)院，煙草研究院，湖南長沙 410128；

2 云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000；3 中國煙草總公司云南省公司，昆明 650224

煙草黑脛病是由煙草疫霉菌(Phytophtora parasitica var. nicotianae)侵染引起具有毀滅性的煙草真菌性病害[1]，于1950年傳入我國，隨后迅速蔓延。目前，煙草黑脛病除在東北寒冷地區(qū)發(fā)生較少外，全國其他煙區(qū)均有較大面積的發(fā)生[2]，對煙草生產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來，有不少學(xué)者就植物提取物對煙草疫霉菌的抑制作用做了大量的研究并取得一些進(jìn)展，如：大蒜對煙草黑脛病有一定的防治效果[3]，青蒿、苦參、蘄艾、廣藿香、金銀花等復(fù)配劑水提取物對煙草疫霉菌的抑制作用[4]，臭蒿乙醇浸提液對煙草疫霉菌的抑制作用[5]等。但以上植物源農(nóng)藥的原材料多存在價(jià)格昂貴、產(chǎn)地局限等問題[6]，加上部分植物源農(nóng)藥防效較低，且在自然環(huán)境中化學(xué)穩(wěn)定性較差等限制因素，因而難以推廣應(yīng)用。因此，植物源農(nóng)藥的研究應(yīng)以著眼于來源豐富，容易批量獲取的植物材料。

紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum Spreng)為菊科澤蘭屬，多年生草本或半灌木植物，原產(chǎn)于墨西哥，20世紀(jì)40年代傳入我國云南，并蔓延至貴州、廣西等地，在2003年被國家環(huán)保總局列入首批入侵國內(nèi)16種外來物種之首[7]。目前，云南80%以上的國土上都分布有紫莖澤蘭，幾乎隨處可見，已對云南農(nóng)、林、牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[8]。為此，近年來，科研人員開展紫莖澤蘭的防除和綜合利用研究。目前已有研究證實(shí)紫莖澤蘭具有抑制植物病原菌的效果，如Sachin等[9]研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭提取物具有廣譜殺滅病原菌的活性；Ahluwalia等[10]發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭花和根的揮發(fā)油具有抗細(xì)菌和真菌的功效。還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭提取物對馬鈴薯晚疫病菌的菌絲生長具有不同程度的抑制作用[11]。譚仁祥[12]發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭中所含有的β-蒎烯、檸檬烯、百里香酚、對-聚傘型花素、阿魏酸、蒲公英甾醇等單萜類、倍半萜類、植物甾體類化合物具有抗菌、消炎、抗病毒活性，而這些抑菌活性成分分布于紫莖澤蘭植株的根、莖、葉、花等不同器官。迄今為止，還未見關(guān)于紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌抑制作用的報(bào)道。為此，本文以煙草疫霉菌為供試菌，探討紫莖澤蘭不同器官的乙醇提取物對煙草疫霉菌的抑制作用，以期為以紫莖澤蘭為原料開發(fā)防治煙草黑脛病的植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

試驗(yàn)用紫莖澤蘭樣品采自云南省羅平縣。鮮樣陰干處理后，60℃烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，得到的粉末于4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試病原真菌

本實(shí)驗(yàn)供試菌種為綠色熒光蛋白標(biāo)記的煙草疫霉菌，由西北農(nóng)林科技大學(xué)單衛(wèi)星教授惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫莖澤蘭不同器官提取物的制備

取10 g紫莖澤蘭各器官粉末分別加入10倍體積的95%乙醇，超聲波提取30 min，抽濾，濾渣反復(fù)提取3次，最后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得膏狀物，用95%酒精定容至l g/mL（即每1 mL提取物中含1 g植物干物質(zhì)），即得到紫莖澤蘭不同器官的乙醇提取物，作為母液，封口保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 含提取物培養(yǎng)基的制備

1.2.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備

參照王革的方法[13]，在無菌條件下，將紫莖澤蘭葉片、莖稈和根系提取物（母液）與已滅菌的燕麥瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，制成30、15、7.5、3.75、1.825 mg/mL 5個(gè)等比濃度梯度稀釋的含藥培養(yǎng)基。

1.2.2.2 含藥培養(yǎng)液的制備

同方法1.2.2.1，在無菌條件下，將紫莖澤蘭葉片、莖稈和根系提取物（母液）與已滅菌的10%V8培養(yǎng)液均勻混合，制成20、10、5、2.5 mg/mL 4個(gè)等比濃度梯度稀釋的含藥培養(yǎng)基。

1.2.3 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制作用

采用菌絲生長速率法[14]測定。以含無菌水的培養(yǎng)基作為對照，每個(gè)濃度重復(fù)3次。接種后置于恒溫培養(yǎng)箱中26℃黑暗培養(yǎng)，待對照的菌絲剛長滿平板后，用十字交叉法測量并記錄菌落生長直徑。用下列公式計(jì)算菌落生長抑制率：

菌落生長直徑(cm)=處理菌落直徑(平均值) -0.5(菌片直徑)

抑菌率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100

毒力計(jì)算方法：查生物統(tǒng)計(jì)幾率值換算表[14]，將抑菌率換算成幾率值，質(zhì)量濃度以對數(shù)值表示，以各提取物不同質(zhì)量濃度的對數(shù)值(x)和菌落生長抑制率的幾率值(y)求取毒力回歸方程y=a+bx，并計(jì)算抑菌中濃度(EC50)。

1.2.4 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌孢子囊產(chǎn)生的影響

參照鄭小波的方法[15]，將新鮮培養(yǎng)的煙草疫霉菌菌絲塊（大小約2×2 mm）8～10塊移入1.2.2.2中不同濃度的含藥培養(yǎng)液中，在26℃、黑暗條件下培養(yǎng)3天。待菌絲長成后，傾去培養(yǎng)液，用無菌水洗去菌絲上的培養(yǎng)液，再加入15～20 mL無菌水重新懸浮菌絲，每皿滴加3～5滴過濾滅菌后的土壤浸提液，置于26℃、黑暗中培養(yǎng)。以后，每隔12～24h換一次水并滴加土壤浸提液。在換水后36～48 h，在10×20倍光學(xué)顯微鏡下檢測孢子囊的數(shù)量，每塊菌落隨機(jī)檢查3個(gè)視野。

1.2.5 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的影響

參照1.2.4中的方法刺激孢子囊產(chǎn)生，將盛放有產(chǎn)生大量孢子囊的菌絲的培養(yǎng)皿置于4℃冰箱中30 min后取出，在26℃培養(yǎng)箱中處理30 min。用微量加樣器吸取游動(dòng)孢子懸浮液4 μL于干凈載玻片上，將懸浮液在載玻片上拖成一條細(xì)短的帶，共取樣4次，在10×10倍顯微鏡下計(jì)算4個(gè)樣本中的游動(dòng)孢子的總數(shù)，求出4 μL懸浮液中游動(dòng)孢子個(gè)數(shù)的平均值。按以下公式計(jì)算每毫升懸浮液中游動(dòng)孢子的個(gè)數(shù)。

游動(dòng)孢子懸浮液濃度(個(gè)/mL)=4μL懸浮液中游動(dòng)孢子平均個(gè)數(shù)×1000/4

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2013對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理和圖表制作，同時(shí)采用SPSS 20進(jìn)行方差分析和多重比較（LSD法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌的抑制作用

由表1和圖1可見，紫莖澤蘭不同器官乙醇提取物均可抑制煙草疫霉菌菌絲生長，但在不同器官、不同濃度間存在較大差異。就各器官的提取物而言，5種濃度的葉片乙醇提取物均極顯著抑制了菌絲的生長；1.825 mg/mL的莖稈、根系乙醇提取物對菌絲的抑制效果均小于2%，其他4種濃度的莖稈、根系乙醇提取物對菌絲生長的抑制效果則達(dá)到了極顯著水平。各器官提取物的抑菌效果均表現(xiàn)隨著作用濃度升高，抑制作用增強(qiáng)的趨勢，抑菌率與藥劑濃度呈正相關(guān)，其中葉片乙醇提取物在30 mg/mL時(shí)的抑菌率最高，達(dá)91.61%。在任一濃度下，不同器官提取物的抑菌率差異均達(dá)顯著或極顯著水平，抑菌率均表現(xiàn)為葉＞莖＞根。

表1 紫莖澤蘭不同器官乙醇提取物對煙草疫霉菌菌絲生長的抑制效果Tab.1 Inhibitory effect of ethanol extract from different parts of E.adenophorum on the growth of mycelium of P.parasitica var. nicotianae

圖1 紫莖澤蘭不同器官乙醇提取物對煙草疫霉菌菌絲生長的影響Fig.1 Effect of ethanol extract from different parts of E.adenophorum on the growth of mycelium of P.parasitica var. nicotianae

由表2可知，紫莖澤蘭3個(gè)器官提取物對煙草疫霉菌的毒力相關(guān)性表現(xiàn)較好，各提取物毒力回歸方程的決定系數(shù)均在0.9以上，說明回歸方程擬合度較高。從EC50來看，對煙草疫霉菌抑菌活性最高的是紫莖澤蘭的葉片，EC50達(dá)7.74 mg/mL，其次分別是莖和根，EC50分別為13.63mg/mL和16.38mg/mL。

表2 紫莖澤蘭不同器官提取液對煙草疫霉菌的毒力比較Tab.2 Comparison of the toxicity of ethanol extract from different parts of E.adenophorum against P.parasitica var. nicotianae

2.2 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌孢子囊產(chǎn)生的影響

如表3和圖2所示，與對照相比，紫莖澤蘭葉、莖、根3個(gè)器官的乙醇提取物對煙草疫霉菌孢子囊的產(chǎn)生均具有明顯的抑制作用(P＜0.01)，其抑制率隨處理濃度的增大而增大。就不同濃度而言，在高濃度(20 mg/mL)下，葉片、根系和莖稈的乙醇提取物對煙草疫霉菌的孢子囊產(chǎn)生的抑制率分別為95.70%、88.32%和62.46%；在低濃度(2.5 mg/mL)時(shí)，葉片、根系和莖稈的乙醇提取物對煙草疫霉菌的孢子囊產(chǎn)生的抑制率分別為53.67%、36.71%和7.10%，不同器官提取物對煙草疫霉菌的孢子囊產(chǎn)生的抑制率存在極顯著差異，表現(xiàn)為葉片＞根系＞莖稈。

表3 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌孢子囊產(chǎn)生的影響Tab.3 Effect of ethanol extract from different parts of E.adenophorum on sporangium yield of P.parasitica var.nicotianae

圖2 紫莖澤蘭不同器官乙醇提取物對煙草疫霉菌孢子囊產(chǎn)生的影響Fig.2 Effect of ethanol extract from different parts of E.adenophorum on sporangium yield of P.parasitica var. nicotianae

2.3 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的影響

紫莖澤蘭不同器官乙醇提取物對煙草疫霉菌游動(dòng)孢子釋放有明顯的抑制作用，各器官均表現(xiàn)出隨處理濃度升高抑制率增大的規(guī)律，不同濃度之間存在顯著或極顯著差異（表4）。在濃度20 mg/mL時(shí)，葉、莖、根的抑菌率分別達(dá)到94.44%、89.14%、90.40%，具有顯著的抑制效果，處理之間差異顯著。當(dāng)濃度下降至2.5 mg/mL時(shí)，根、莖提取物對煙草疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的抑制作用，與對照相比已無顯著差異，而葉片乙醇提取物的抑制率仍有34.09%，依然表現(xiàn)出顯著性。

表4 紫莖澤蘭不同器官提取物對煙草疫霉菌游動(dòng)孢子釋放的影響Tab.4 Effect of ethanol extract from different parts of E.adenophorum on zoopore release rate of P.parasitica var.nicotianae

3 討論與結(jié)論

3.1 紫莖澤蘭提取物對煙草疫霉菌具有較好的抑菌活性

本研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭各器官的乙醇提取物對煙草疫霉菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，抑制率與濃度呈正相關(guān)，并且隨著濃度的下降，不同器官之間的差異變大。抑制率表現(xiàn)為葉片＞莖稈＞根系，紫莖澤蘭葉片的乙醇提取物的EC50為7.74 mg/mL，小于莖桿和根系提取物的EC50分別為13.63和16.38 mg/mL，器官間差異的趨勢與李麗等[16]研究結(jié)果一致，可能與不同器官中的活性物質(zhì)含量的高低有關(guān)，有研究表明紫莖澤蘭中倍半萜化合物對病原真菌有良好的抑制作用[17-18]，因此可以推測紫莖澤蘭提取物中含有較多的倍半萜類化合物；也可能與不同器官活性成分在提取溶劑（95%乙醇）的溶解性不同有關(guān)。總體上，與同類研究相比，紫莖澤蘭乙醇提取物的抑菌活性較為理想，如：10 mg/mL的青蒿、苦參、蘄艾、廣藿香、金銀花復(fù)配水劑的對煙草疫霉菌抑菌率為18.72%[4]；臭蒿水乳劑對煙草疫霉菌的EC50為5.93 mg/mL[5]；蕓薹屬蕪菁、芥菜和油菜的乙醇提取物對疫霉菌菌絲生長的EC50值分別為11.39、9.18 和5.88 mg/mL[19]。以上研究表明，紫莖澤蘭乙醇提取物的抑菌效果略優(yōu)于或與同類制劑相當(dāng)。紫莖澤蘭作為一種惡性外來入侵植物，與以上中草藥和人工作物相比具有來源廣泛和成本低廉的優(yōu)勢，因此利用紫莖澤蘭提取物研制植物源農(nóng)藥防治煙草黑脛病具有潛在應(yīng)用前景。

3.2 紫莖澤蘭提取物的抑菌機(jī)理

孢子囊是煙草疫霉菌無性繁殖中的主要繁殖結(jié)構(gòu)，在自然條件下可釋放游動(dòng)孢子，而孢子囊和游動(dòng)孢子可借雨水或灌溉水傳播，引起再侵染[15]。因此，植物提取物對病原菌孢子囊及游動(dòng)孢子的抑制作用，也常作為藥劑防治效果好壞的參考依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭根、莖、葉3個(gè)器官的乙醇提取物對煙草疫霉菌的生長發(fā)育具有明顯的抑制作用，在較高濃度時(shí)能降低煙草疫霉菌的孢子囊產(chǎn)生量和游動(dòng)孢子釋放量，且抑制效果均表現(xiàn)為葉片提取物優(yōu)于莖桿和根系提取物，在低濃度下只有葉片仍有較好的抑制效果。抑制效果的產(chǎn)生可能是由于提取物有效干擾了煙草疫霉菌菌絲的正常生長，從而導(dǎo)致菌絲形成孢子囊受阻，不能釋放出游動(dòng)孢子，有效阻止了病菌再侵染的發(fā)生。另外，莖桿和根系提取物對煙草疫霉菌菌絲生長和孢子囊萌發(fā)的抑制率的規(guī)律并不完全一致，可能與根系及莖稈中活性物質(zhì)的作用位點(diǎn)和作用機(jī)理不同有關(guān)。

本試驗(yàn)是一個(gè)探索性的研究，今后可純化提取物的成分以進(jìn)一步明確紫莖澤蘭中的抑菌成分，通過結(jié)構(gòu)改造獲得更高效、更安全的植物源殺菌劑，并開展藥劑處理后的病原菌酶活性及形態(tài)學(xué)的變化研究，從細(xì)胞、遺傳物質(zhì)水平探索紫莖澤蘭抑菌的作用機(jī)理。