農作物SNP芯片技術及其在分子育種中的應用

吳 凱

（晉中市農業委員會，山西晉中 030600）

全球人口將在2050年突破90億，而目前主要農作物的產量已經無法滿足人口的快速增長帶來的對糧食的巨大需求[1]，加上世界耕地面積不斷減少、全球變暖可能引發的氣候異常或病蟲害暴發等因素，農作物育種在未來幾十年內面臨著嚴峻挑戰[2]。因此，充分利用目前作物基因組學取得的研究成果，將先進的分子生物技術與常規育種技術相結合，從本質上推動作物育種領域的綠色革命，對緩解甚至解決全球糧食安全問題具有重要意義。

1 育種分子標記

作物分子育種的核心是基于分子標記的輔助選擇（marker-assisted selection，MAS），分子標記最早始于以限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）為代表的第1代分子標記，隨后發展出目前應用最廣的第2代標記——簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標記，在育種領域發揮了巨大作用，但隨著育種精度要求的不斷提高，以及小麥等多倍體作物分子育種工作的開展，SSR標記開始出現局限性。一是SSR序列在基因組中的分布不均勻且是有限的，其與目標基因連鎖不緊密，容易在分子輔助選擇過程中丟失；二是SSR標記依賴于凝膠電泳技術，用于規模育種中則通量低、代價高；三是SSR標記在多倍體中的亞基因組特異性較差，會影響圖譜構建或基因定位結果的準確性。

隨著測序和組裝技術的進步，越來越多的農作物物種已經繪制全基因組草圖。基于基因組數據，科研人員診斷、開發了第3代新型標記——單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標記，SNP標記具有密度高、遺傳穩定的特點，而且幾乎都以二等位多態性存在[3]，檢測時無須象RFLP，SSR那樣對片段的長度作出測量，極易實現自動化。

2 芯片技術平臺

SNP芯片技術就是將第3代SNP標記固定在載體上形成密集的寡核苷酸探針陣列，再與目標DNA進行等位基因特異性反應，根據反應后信號的有無和強弱確定SNP位點的多態性，該技術可以對作物全基因組實現快速、高密度的掃描，特別是對育種工作中的大量群體樣本進行基因型鑒定時，單個檢測位點成本很低，是一種高集成、高通量、微型化和自動化的檢測SNP的手段。目前，芯片基因型鑒定平臺采用的是Illumina公司的BeadArray技術和Affymetrix公司的Axiom技術。

Illumina BeadArray技術是將特定寡核苷酸覆蓋到微珠上，將其嵌入到裝有樣本DNA的、能與其互相匹配的微孔中發生雜交，再通過熒光掃描實現對SNP的高通量識別和分型。BeadArray技術可以分析更高密度的陣列，即能分析更多的SNP位點。基于雙色單堿基探針，每個樣本可以同時掃描3 000到500多萬個SNP位點。Affymetrix則采用了基于光蝕刻的GeneChip陣列與等位基因特異性寡聚體進行雜交，該寡聚體包含了能與SNP完全匹配的探針[4]。AffymetrixAxiom技術基于雙色和30-mer探針的連接測定，可同時分析384個樣品的50K個SNP位點。

3 芯片技術在育種中的應用

水稻是最早完成全基因組測序的農作物，因此，其芯片研發工作也起步最早。目前，已經開發出6K，44K，50K和1M等滿足不同育種用途的SNP芯片（表1）。在其他糧食作物中，玉米3K/50K/600K、大豆180K、馬鈴薯20K芯片也先后研發成功。小麥9K/90K/660K、大麥9K、燕麥6K和黑麥600K等麥類作物芯片也已用于生產。而在經濟作物中，目前已研制出花生58K、棉花63K和向日葵25K芯片用于育種（表1）。

芯片技術已被廣泛用于育種領域中的各個環節中，并且根據各環節實際需求開發出了不同大小的芯片以及鑒定平臺。例如，在全基因組關聯分析（Genome-wide Association Studies，GWAS）和連鎖作圖中需要對數千個樣本掃描數萬個標記，而在標記輔助回交（Marker-assisted Backcrossing，MABC）中只需要對樣本掃描數百個與目標基因緊密連鎖的標記。因此，在作物分子育種中，一般先利用高密度芯片快速準確地定位目標基因，對于多基因控制的農藝性狀則確定其數量性狀位點，而在接下來的回交育種和輪回選擇等工作中，可使用更具有針對性的、基于競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）的SNP芯片對后代單株進行選擇。此外，研究人員還開發出了基于芯片技術的分子育種工具MBDT（Marker-assisted Backcross BreedingTool）。該工具包括數據驗證、表型分析、連鎖圖譜構建、QTL分析、基因組顯示和MABC所需樣本量，使目前先進的分子育種技術操作簡單化、結果直觀化，將大大提高傳統育種家使用SNP芯片的比例，推動農業作物進入以科學理論為基礎的分子育種時代。

4 存在問題和展望

在水稻、玉米等二倍體模式作物中，對基因組以及基因功能的研究較為深入，分子育種也取得了很好的成果。而在燕麥等冷門作物或者小麥等具有復雜基因組的多倍體作物中，基于全基因組水平的功能基因挖掘與驗證工作才剛剛起步，在利用芯片技術選育品種過程中很可能會出現2個問題。

第1個問題是作物基因型與預期表型不一致，這也是限制分子育種應用的一個重要因素。闡明控制作物產量、品質、抗性等重要農藝性狀的基因及其調控機制，是分子育種的理論基礎，對此，科研人員開展多方面的研究，如泛基因組重測序、與模式作物比較基因組學分析、育種環節結合目標基因功能驗證、引入轉錄組學/蛋白組學/代謝組學的研究成果等等，以期減少或消除基因型與表型不一致的情況。

第2個問題是芯片標記信息不全面。由于芯片標記主要是基于已測序作物品種的基因組序列開發的，而在育種過程中常常會引入作物的農家品種、野生品種甚至近緣種的優異基因組片段，因此，現有育種芯片可能無法識別作物不同遺傳資源中的特有變異類型，最終限制了外源片段的導入。例如，早期基于B73和Mo17這2個溫帶玉米自交系測序草圖開發的SNP芯片，無法識別出熱帶玉米基因組中的優異等位變異[24]，為此，已有機構開始對包括熱帶自交系在內的玉米品種進行大規模重新測序，以期開發出信息量完整的SNP芯片用于育種。

在接下來的10 a內，隨著組學技術的進一步發展和功能研究的不斷深入，SNP芯片的成本將繼續降低，功能標記的準確性和覆蓋品種的完整性則會大幅提升，鑒定平臺和育種軟件的簡潔化、智能化將使芯片技術在傳統育種家以及發展中國家大范圍普及，世界農業將真正進入科學、高效的分子育種時代。

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