循環(huán)腫瘤細胞在肺癌診療中的臨床應用與進展

孫婧怡 馬禮兵

桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，桂林醫(yī)學院呼吸疾病研究所，廣西壯族自治區(qū)教育廳高校呼吸疾病重點實驗室（廣西桂林 541001）

肺癌在近50年來是許多國家中發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤之一，極大的威脅著人們的健康和生命。根據(jù)肺癌在疾病診斷之前常轉(zhuǎn)移的特點，遠處轉(zhuǎn)移肺癌患者的無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）更是顯著降低［1］。目前腫瘤的臨床診斷仍以固體活檢為確診腫瘤組織學及其分期的金標準，但實際操作有一定的限制并存在風險性，特殊位置及一些轉(zhuǎn)移部位的腫瘤通常可能無法進行活檢，且腫瘤的異質(zhì)性并不能被固體活檢完全捕獲。臨床實踐中，腫瘤活檢標本的目的是預測和評估治療反應的特異性生物標志物，并且在同一原發(fā)腫瘤的解剖學上不同部位及其轉(zhuǎn)移灶顯示的遺傳圖像也不盡相同［2］。顯然，固體活檢不足以對進展期腫瘤的異質(zhì)性進行表征，更不會產(chǎn)生完善的基因組圖像［3］。近年來，液體活組織檢查——即液體活檢以非入侵的方式引起了研究者們的極大關(guān)注，其得益于可對患者進行多次采樣且風險性極低。液體活檢的研究領(lǐng)域是通過提高從正常周圍血細胞中分離循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的富集分析的靈敏度和特異性從而對腫瘤基因型進行遺傳分析，以便更好的對患者進行分類分層干預治療并有效的監(jiān)測患者反應［3］。此方法不僅能改善臨床預后，更可通過提供適合患者腫瘤基因構(gòu)成的特定藥物來達到“個性化”治療的目標。

更多研究表明，通過分析患者血漿或血清中腫瘤特異性遺傳改變可改善腫瘤患者的預后，并可對靶向治療期間所產(chǎn)生的獲得性藥物抗性突變進行檢測。在基因突變的評估方面可通過重復活檢來闡明分析腫瘤進展的分子生物學特征，尤其在NSCLC的診療中［4］。因此作為“液體活檢”的CTC被譽為腫瘤基因組的潛在替代物。過去十年中，越來越多研究表明CTC在NSCLC的診斷、治療、疾病監(jiān)測及預后目的中起到重要作用［5］。為了更好的了解CTC在早期和晚期癌癥患者的診療及預后中的作用，以及其與固體活檢的區(qū)別，以下將對近年來CTC在肺癌診療中的臨床應用與進展做簡要闡述和討論。

1 CTC概述

CTC是存在于癌癥患者外周血中各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱，這個概念是由澳大利亞籍醫(yī)生Thomas Ashworth于1869年首次提出的，其特異性分子檢測在近幾年開始受到高度關(guān)注［6］。CTC為罕見的上皮細胞，每106～109個血細胞發(fā)生率約為1 CTC，由不同表型、基因組和功能特征的細胞組成［7］。大部分CTC因自發(fā)或診療操作從原發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤病灶脫落進入循環(huán)，在外周血發(fā)生凋亡或被吞噬，而逃逸的少數(shù)腫瘤細胞可通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導細胞表型的改變，進而致使上皮標志物的下調(diào)并增加其侵襲和遷移的能力［8］。當腫瘤＞2 mm3時更易于黏附或穿過血管壁，從原發(fā)腫瘤中分離出的腫瘤細胞進入血管系統(tǒng)并循環(huán)到遠處，最終以“自我播種”的過程發(fā)展為遠處轉(zhuǎn)移灶促進癌癥進展［6］。據(jù)研究推測，CTC是有選擇的向血液中進行釋放，在經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)的過程中，CTC的遷移與巨噬細胞、血小板、以及趨化因子都密切相關(guān)［9］。由于CTC含有原發(fā)性腫瘤的表型和遺傳信息，通過分離捕獲CTC對轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性腫瘤進行液體活檢引起了研究者們極大的關(guān)注。為平衡CTC隔離技術(shù)的發(fā)展和臨床實踐之間的關(guān)系，CTC分離方法的特異性、靈敏度、純度及生存力等關(guān)鍵因素是需要被考慮的，它們決定了后續(xù)的分子和基因組分析以及用于離體藥物測試的培養(yǎng)［9］。CTC不僅可以在已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者血液中被檢測到，且高效的CTC分離方法對早期發(fā)現(xiàn)微小腫瘤具有可觀的前景。新分子生物標志物的不斷發(fā)展對肺癌患者治療具有突破性進展，在肺癌個性化治療面前，液體活檢可以說是一個重要的轉(zhuǎn)折點。CTC突變分析的評估能夠“實時”的進行調(diào)控和監(jiān)測治療效果，這對未來肺癌的治療提供了有力前景。

2 CTC與肺癌

目前液體活檢是肺癌研究領(lǐng)域一個新的擴展領(lǐng)域，可提供早期診斷并預估轉(zhuǎn)移復發(fā)和進展風險，對其藥物治療進行實時監(jiān)測和鑒定。在高風險肺癌患者中，可通過CTC進行早期疾病檢測；在晚期肺癌患者中，重復進行液體活檢分析CTC的分子特征對其疾病進展也至關(guān)重要［10］。因此，CTCs檢測和計數(shù)可應用于肺癌患者的早期診斷、治療靶點的識別、耐藥機制的實時監(jiān)測和預后等。

2.1 CTC在肺癌耐藥突變診斷和鑒定中的作用目前分子鑒定是NSCLC治療選擇的關(guān)鍵步驟，CTC可表征單個活腫瘤細胞的“組學”，或產(chǎn)生基于CTC的細胞系來研究轉(zhuǎn)移機制，是下游分析的理想選擇［11］。經(jīng)大量研究表明在NSCLC患者的血液樣本中，表皮生長因子受體（EGFR）基因的突變和其所匹配的原發(fā)腫瘤組織活檢相一致［12］。目前在指導臨床藥物選擇方面可通過針對CTCs檢測基因突變和藥物敏感性的方法。PUNNOSE等［13］通過定量PCR的方法分析在NSCLC患者的CTC對于EGFR突變狀態(tài)的檢測，雖然其靈敏度較低，但仍可發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與腫瘤活檢的結(jié)果一致；BREITENBUECHER等［14］也應用RT-PCR檢測應用TKI治療的肺癌患者血液中EGFR外顯子19的缺失，發(fā)現(xiàn)突變狀態(tài)的CTCs增加也許表明發(fā)生了EGFR TKI抗性以及有疾病復發(fā)的預兆；同時發(fā)現(xiàn)肺癌患者血液樣品中CTC數(shù)量的增加與腫瘤進展有關(guān)，出現(xiàn)新的EGFR突變隨之其細胞數(shù)量也增加［15］。另外有研究顯示，在NSCLC患者的CTCs中，檢測發(fā)現(xiàn)EGFR（T790M）位點的突變則該患者會對吉非替尼或厄洛替尼的治療產(chǎn)生耐藥，進而導致疾病的不良預后和進展［12］。這些都說明了CTCs在EGFR突變的檢測中可以發(fā)揮改善肺癌治療方案的作用。除EGFR基因突變外，據(jù)統(tǒng)計在所有NSCLC患者的病例中約2%～7%發(fā)生ALK基因重排，因此進行評估篩選ALK基因重排的肺癌患者是必要的［16］。PAILLER等［16］對ALK陽性組和陰性組的NSCLC患者通過應用過濾富集技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)進行評估，結(jié)果顯示陽性組患者血液在每1 mL中含4個或更多具有ALK基因重排的CTC，而陰性組患者幾乎未檢測到。在克唑替尼治療期間發(fā)現(xiàn)，其中5位含有ALK重排的CTC患者中有4位在治療期間攜帶ALK重排，這對NSCLC患者在接受克唑替尼治療時進行實時評估其CTC中ALK基因重排的存在具有重要的意義［16］。此外在藥敏檢測方向上，YU等［17］通過對部分藥物研究發(fā)現(xiàn)CTCs敏感的藥物有紫杉醇和卡培他濱，而其耐藥的藥物有氟維司群和奧拉帕尼。可以說CTC藥物敏感性測試揭示了其潛在新治療靶標，通過優(yōu)化CTC培養(yǎng)條件可更好調(diào)整個體肺癌患者疾病過程中的最佳療法。

這些研究均說明了CTCs可有助于腫瘤異質(zhì)性的評估且CTC基因組可預測癌癥進展，在出現(xiàn)抗藥時進行替換針對治療。實時掌握肺癌患者的耐藥性和復發(fā)相關(guān)的重要數(shù)據(jù)對其分層指導靶向治療至關(guān)重要，這為肺癌患者的診斷和治療提供了新的視角，極具研究價值。

2.2 CTC在肺癌的治療監(jiān)測方面目前研究顯示“液體活檢”在肺癌的治療檢測方面具有潛在發(fā)展。應用免疫藥物治療肺癌的歷程中，評估CTC的腫瘤反應是目前廣泛研究的問題。NICOLAZZO等［18］通過在應用基于抗程序性死亡受體-1（抗-PD-1）的nivolumab藥物治療的肺癌患者中，富集分離CTC進而評估程序性死亡配體-1（PDL-1）的蛋白表達，得出了CTC作為預測的標志物與抗-PD-1藥物的相關(guān)性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在治療6個月后可在所有患者血液中檢測到CTC，且檢測到PDL-1陽性的CTCs和腫瘤的不良進展密切相關(guān)［18］。此發(fā)現(xiàn)證明了CTC在預測nivolumab藥物對肺癌治療反應的潛在應用，不足之處在于目前實驗隊列不夠大。CTC的監(jiān)測在肺癌的靶向治療方面表現(xiàn)出其重要作用。目前最常見的是EGFR基因突變、ALK和ROS-1基因重排相關(guān)的肺腺癌（AC）［19］，還有包括BRAF、AKT1、ERRB2、PIK3CA和RET的基因組畸變［20］。CTC在“液體活檢”中彌補了組織活檢不能充分反映腫瘤細胞異質(zhì)性的特點，更有利于對疾病的進展進行動態(tài)監(jiān)測［21］。MARCHETTI等［15］通過CTC檢測EGFR原發(fā)性腫瘤患者的突變檢出率為84%，其余與原發(fā)腫瘤不匹配的突變推測是來源于腫瘤的異質(zhì)性。同樣用相似的方法在研究NSCLC CTC中ALK重排和ROS1重排的過程中，與組織活檢標本進行比較發(fā)現(xiàn)都可檢測到相同突變基因的CTC［19］。因此可推斷CTC的基因組對肺癌具有預測作用，進而可以針對性治療其出現(xiàn)的繼發(fā)性抗藥。

迄今為止，CTC在肺癌遠處轉(zhuǎn)移的診斷中的作用及與臨床分期間的關(guān)系眾說紛紜。KURUSU等［22］分別對IIA，ⅡB和ⅢA期的癌癥患者治療前血液中的CTC進行檢測分析發(fā)現(xiàn)其癌胚抗原的檢測率明顯較IA和IB期升高；而WENDEL等［23］對非小細胞肺癌患者化療前的血液樣本進行CTC檢測分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期與患者的CTC計數(shù)并無明顯差別。還有研究顯示CTCs與小細胞肺癌患者PS評分、臨床分期、有無遠處轉(zhuǎn)移、NSE及LDH水平有關(guān)，因此檢測CTCs有利于更精確的病情評估［24］。不同研究結(jié)果提示仍需大量樣本進行多次實驗才能廣泛應用于臨床監(jiān)測，但確定的是通過CTC連續(xù)監(jiān)測肺癌的治療反應極具價值和研究前景。

2.3 CTCs在NSCLC中的預后意義在NSCLC患者中，目前CTCs可在其各個階段檢測到，因此動態(tài)變化的CTC可以反映NSCLC患者的預后［16］。KREBS等［25］通過對先前未經(jīng)治療的Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者進行了標準化療周期前后的CTCs進行富集分析，發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)Ⅳ期患者高于Ⅲ期，進而推斷CTC的數(shù)量與NSCLC患者的預后呈負相關(guān)，即CTC數(shù)量越多患者的預后越差且生存時間越短。另外在早期肺癌中，手術(shù)前后檢測到CTC的升高與腫瘤的進展惡化也有關(guān)。BAYARRI-LARA等［26］通過對NSCLC根治性手術(shù)治療的患者進行了CTC的評估，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs的數(shù)量與復發(fā)率和PFS呈負相關(guān)；我國研究者對晚期NSCLC患者的CTCs進行預后分析［27］，其中87%的患者檢測出CTC，得出了基線CTC＞8時可作為患者PFS和OS降低的預測指標；CHINNIAH等［28］報告中顯示48例進行CTC檢測的晚期NSCLC患者的隨訪記錄，近70%的患者在臨床證實復發(fā)之前6個月表現(xiàn)出CTC計數(shù)升高。同時CTC作為“實時”液體活檢可隨時監(jiān)測腫瘤治療進展，在冷凍治療中CHUDASAMA等［29］對晚期NSCLC患者進行了手術(shù)前后其外周血CTC脫落的計數(shù)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTC數(shù)量升高提示其預后不良。以上研究均表明，CTC計數(shù)不僅是在預后，其在治療過程中不斷監(jiān)測CTC的動態(tài)變化更有利于觀測疾病的進展情況。

在上述研究中發(fā)現(xiàn)，在NSCLC的藥物化療、放療和手術(shù)后CTC的計數(shù)以及動態(tài)變化均可應用于預后的指標。而CTC檢測目前并未劃為常規(guī)檢查的原因主要有兩點：（1）CTC的檢測方法目前都有待完善，各有利弊，其靈敏度及純度都有待提高；（2）大部分研究都基于小的樣本量，需大量數(shù)據(jù)提供有力證據(jù)。但基于現(xiàn)有實驗可以證實CTCs在NSCLC中具有相對可靠的預后因素，通過改善其檢測方法可更好的應用于臨床研究。

3 討論

綜上所述，肺癌患者尤其是在NSCLC患者的治療研究中目前最新進展就是分子生物標志物的發(fā)現(xiàn)與檢測。經(jīng)多項研究證明，在肺癌的靶向治療針對疾病進展過程中患者出現(xiàn)耐藥的情況，CTC具有可實時檢測到EGFR突變或ALK重排等可隨時間變異的腫瘤基因的遺傳異質(zhì)性［30］。相對于傳統(tǒng)組織活檢單點取樣只能定格標本的特點，通過CTC計數(shù)來評估NSCLC患者的預后是一項重大突破，這些在肺癌的治療過程中對其進行“實時”監(jiān)測、對抗性標記物的早期檢測、預測患者結(jié)果、并調(diào)整治療方案和改善治療干預措施具有重要意義。作為一種新型替代生物標志物CTC對肺癌的預后價值不可估測，且在未來遺傳學研究中CTC檢測的液體活檢的方式還可提供大量有價值的信息。在藥物經(jīng)濟學評估中，液體活檢在癌癥治療的有限預算中可能是兼具性價比的有前景的篩查手段［31］。

然而，CTC的檢測并未廣泛應用于臨床也是由于這個領(lǐng)域有很多問題依然有待解決。CTC更多的是處于早期階段有其局限性，例如CTC檢測采樣系統(tǒng)的標準化、技術(shù)可應用于臨床常規(guī)篩查的實用性、下游對CTC進行分析的可靠性以及CTC計數(shù)和放射成像之間可能的關(guān)聯(lián)性等。當然除CTC外，進一步發(fā)掘新的液體活檢標志物如血小板、ctDNA、exosomes、secretome等，同時將其與臨床實踐緊密相連，建立癌癥患者的新型標志物樣本數(shù)據(jù)庫，這對未來癌癥患者的診療具有深遠意義。總之，CTC的發(fā)現(xiàn)以及其臨床研究為肺癌的精準治療開啟了嶄新的大門，在不斷的探索實踐中液體活檢技術(shù)及肺癌患者的個性化治療將廣泛應用于臨床。