老年心肌梗死患者長期服用氯吡格雷后腸道轉(zhuǎn)運體P糖蛋白和多耐藥基因C4546T的表達

趙 瑩 馮思建 劉雪晶 張丹丹 劉明明 盧婷婷 宋 靜

(牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林是預防心肌梗死復發(fā)的主要治療方案，但用藥后仍時有復發(fā)，可能與氯吡格雷耐藥有關〔1〕。氯吡格雷為腸道轉(zhuǎn)運體P糖蛋白的底物，而P糖蛋白是由多耐藥基因(MDR)表達的一種能量依賴性跨膜蛋白，可將作用底物由細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，降低藥物的吸收和生物利用度〔2〕。目前已知的MDR 60多個基因多態(tài)性位點(SNPs)中，外顯子32號的C4546T基因多態(tài)性可發(fā)揮多種功能〔3〕。研究顯示，MDR1 C4546T基因可調(diào)控氯吡格雷在腸道中的代謝〔4〕。本研究擬分析連續(xù)服用氯吡格雷1年以上的老年心肌梗死患者和健康老年體檢者淋巴細胞上P糖蛋白的表達情況和C4546T基因多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年6月至2016年10月在牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院心內(nèi)科住院的連續(xù)服用氯吡格雷1年以上的老年心肌梗死患者106例為實驗組。排除標準：①同時服用血小板糖蛋白受體抑制劑者；②合并循環(huán)系統(tǒng)疾病，出血高危者；③嚴重肝腎功能障礙、惡性腫瘤者。其中男42例，女64例，年齡60～91〔平均(70.65±13.42)〕歲。選取同期在本院行健康體檢的老年志愿者62例對照組，男27例，女35例，年齡60～88〔平均(69.41±10.85)〕歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2標本與試劑 抽取兩組受試者空腹外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理后冷藏待測；Trizol總RNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司，Taq酶、隨機引物購于寶生物工程(大連)有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.3方法

1.3.1P糖蛋白測定 流式細胞上樣管中加入抗凝全血13 μl、抗-P糖蛋白抗體6 μl，振蕩均勻；每個樣本均設置未加抗體的空白對照。室溫下避光靜置20 min，滴加2 ml紅細胞裂解液，振蕩均勻，避光靜置10 min，2 000 r/min離心10 min；除去上清液、滴加3 ml血球稀釋液，振蕩均勻，2 000 r/min離心10 min，重復操作2次；加入500 μl稀釋液，振蕩均勻后上流式細胞儀檢測。

1.3.2外周血單個核細胞總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 人淋巴細胞分離液處理EDTA抗凝血得到單個核細胞，Trizol提取總RNA，紫外分光光度法檢測濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應體系：總RNA 2 μl、隨機引物1 μl、雙蒸水12 μl，70℃反應10 min，冰上冷卻，2 000 r/min離心5 min，加入dNTP 10 μl、MMLV-RT 5 μl，混合均勻，37℃反應40 min，-20℃保存。

1.3.3PCR擴增及測序 依據(jù)MDR C4546T序列設計引物，上游：5′-CGACGAACTACCGTTTCTTT-3′，下游：5′-TAATCCGTCACTGAGCTACT-3′，由北京源宜基因科技有限公司合成。PCR反應體系20 μl：cDNA 1 μl、dNTP 3 μl、Taq酶0.5 μl、上游和下游引物分別1 μl、雙蒸水13.5 μl。反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。行瓊脂糖凝膠電泳，檢測呈陽性的結(jié)果送北京源宜基因科技有限公司測序。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1流式細胞術檢測P糖蛋白情況 實驗組P糖蛋白在淋巴細胞膜上表達水平(22.14±7.61)明顯高于對照組(10.89±4.46，P<0.05)；實驗組中T/C型表達水平明顯高于C/C型、T/T型及對照組各基因型(均P<0.05)；對照組C/C型、T/C 型、T/T型P糖蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

2.2總RNA提取及C4546T目的片段擴增情況 分離外周血中單個核細胞、提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示存在7、15、20 S 3條清晰條帶，A270/A290比值為2.15，加樣孔及周圍未檢出DNA。反轉(zhuǎn)錄后PCR擴增生成與目的產(chǎn)物一致的210 bp片段，見圖1。

表1 兩組各基因型P糖蛋白表達比較

與實驗組T/C比較：1)P<0.05

圖1 總RNA提取及C4546T目的片段

2.3兩組C4546T突變基因電泳和測序情況 見表2。實驗組C4546T突變基因陽性率〔50.94%(54/106)〕明顯高于對照組〔40.32%(25/62)〕(χ2=5.925,P<0.05)。雙向測序后用DNAstar軟件處理后比較，兩組均以C/C型比例最高，與T/C、T/T型組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；實驗組T/C型比例明顯高于對照組(P<0.05)。C4546T突變基因陽性在服用氯吡格雷1年以上的老年心肌梗死患者中發(fā)生風險是健康老年人群的1.64倍，T/C基因型出現(xiàn)頻率是健康老年人群的2.69倍。

表2 兩組 C4546T突變基因陽性患者測序情況〔n(%)〕

與本組C/C比較：1)P<0.05

3 討 論

氯吡格雷與阿司匹林聯(lián)用是目前預防心肌梗死復發(fā)的主要方案，但相關研究發(fā)現(xiàn)，P糖蛋白在不同人群中分布具有差異性，可導致氯吡格雷療效不同〔5〕。體內(nèi)正常組織中P糖蛋白可發(fā)揮保護作用，腸道組織中其可作為屏障，阻止藥物代謝產(chǎn)物的吸收，造血干細胞高表達P糖蛋白可減輕藥物和毒性物質(zhì)的損傷〔6〕。目前，該領域的研究多集中在MDR表達多態(tài)性對血液藥物濃度分布或腫瘤細胞中藥物濃度的影響〔7〕。但關于氯吡格雷抵抗與P糖蛋白表達方面的研究仍鮮有報道。

氯吡格雷是P糖蛋白作用底物，長時間服用氯吡格雷會誘導體內(nèi)組織細胞，特別是淋巴細胞的P糖蛋白表達，進而影響氯吡格雷在細胞中的分布，影響其藥效作用，甚至出現(xiàn)耐藥性。相關研究發(fā)現(xiàn)，P糖蛋白是由MDR基因編碼，目前已發(fā)現(xiàn)C4546T位點上的基因突變，之前的C被T取代，改變了P糖蛋白的表達水平〔8〕。本研究結(jié)果提示，C4546T基因突變率與老年心肌梗死患者長期服用氯吡格雷存在相關性，其中T/C基因型P糖蛋白表達與患者氯吡格雷耐藥相關，可能參與了耐藥機制的形成。

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5楊慎先，李友金，武 剛，等.雜交技術對老年多支復雜冠心病患者早期療效及預后的影響〔J〕.中國老年學雜志，2017；37(3)：583-5.

6鄭 廣.基因芯片分析急性心肌梗死與穩(wěn)定型心絞痛患者外周血差異基因表達譜〔D〕.長春：吉林大學，2016.

7白 瑩.急性冠脈綜合征患者氯吡格雷代謝基因多態(tài)性與抗血小板功能的注冊研究〔D〕.北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2014.

8于勝國.差異性劑量的硝酸甘油與氯吡格雷聯(lián)合療法對冠心病心絞痛患者的療效及預后分析〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2017；16(1)：97-8.