老年肺癌晚期酪氨酸激酶抑制劑治療后循環腫瘤細胞與T細胞亞群的相關性

涂長玲 江 波 金從國 何文杰 朱 穎

(昆明醫科大學第三附屬醫院 云南省腫瘤醫院干部醫療科，云南 昆明 650118)

肺癌是我國發病率最高的惡性腫瘤之一，約有 50%的患者年齡在 65 歲以上〔1〕。含鉑雙藥化療在晚期非小細胞肺癌(NSCLC)一線治療領域中的標準地位已經確立，同時也達到了其療效平臺〔2，3〕。對于>65歲或體力狀態(PS)評分>2分的老年NSCLC患者，化療往往會引起嚴重的毒副反應，不能耐受。化療在殺傷腫瘤細胞同時，也對機體正常細胞造成破壞和殺傷，使得患者的免疫功能受到損傷〔4〕，對療效產生不利的影響。表皮生長因子受體(EGFR)突變型患者對EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物的有效率可達65%～83%，且副作用輕耐受性好，EGFR-TKI類藥物已成為老年EGFR突變晚期NSCLC的一線治療藥物。目前利用外周血循環腫瘤細胞(CTC)檢測EGFR突變已成為肺癌領域研究的熱點〔5，6〕。經過TKI治療后患者細胞免疫抑制狀態及細胞免疫調節功能得以改善〔7〕，但外周血CTC與細胞免疫功能相關性尚未明確。本研究以晚期老年NSCLC為研究對象，以外周血CTC為載體，旨在探討CTC表達與T細胞亞群、自然殺傷(NK)細胞及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 云南省腫瘤醫院2012年9月至2014年5月收治且經病理組織學診斷的晚期NSCLC患者66例，其中男40例，女26例，年齡65～78歲，中位年齡68歲，病理類型：腺癌58例，鱗癌8例。TNM分期：ⅢB期4例，Ⅳ期62例，ECOG標準PS評分0～3分。治療前后均行胸腹部CT、彩超、顱腦磁共振成像(MRI)、心電圖，血常規、血生化及腫瘤標志物檢查，預計生存在3 個月以上，心、肝、腎功能基本正常，無免疫系統疾病。

1.2治療方法 隨機從以下3種EGFR-TKI類藥物中任選一種。吉非替尼片(阿斯利康公司生產)使用劑量為每次250 mg，口服，1次/d；厄洛替尼片(美國羅氏公司生產)使用劑量為每次150 mg，口服，1次/d；鹽酸埃可替尼片(浙江貝達藥業公司生產)使用劑量為每次125 mg，口服，3次/d。無論選擇何種藥物均至少服用1個月。

1.3標本采集 所有患者在治療前先從肘正中靜脈中抽血5 ml，加入肝素抗凝混勻，并在采集后2 h內進行檢測。

1.4抗體及試劑 CD45-PC5、CK18-FITC、EGFR-PE、NH4Cl溶血素，均購于美國Beckman coulter公司。流式細胞儀EPICS XL(美國Beckman coulter公司)。

1.5分選CD45-CK18+細胞 將外周血20 ml分成20份加入5 ml的無菌試管中，每管1 ml；每管均加入CD45-PC5、CK18-FITC各200 μl(按標準100 μl外周血加入20 μl的試劑量)，避光保存30 min；加入NH4Cl溶血素4 ml，反復溶血，直到液體透亮，離心后加入培養液待分選；消毒ALTRA流式室，調節室內溫度到8℃左右，開機，換上偏振板，進入SORT界面，調整Freq、Drive參數，上Flow-Check，找到分選時的Delay，打開檢測CD45-CK18+的方案中以FS PEAK為閾值，在SORT功能，按Receive，接受上面的分選參數，確定檢測后，設置SORT的左右收集細胞群，一般左邊為CD45-CK18+細胞，右邊為非CD45-CK18+細胞，收集數目根據要求設置，同時在樣本收集處安裝收集試管，上分選試管，開始收集細胞，收集過程中需要全程振蕩，同時每30 min需要觀察。分選CD45-CK18+細胞近1 000個就可以結束。

1.6流式細胞測定 各采集TKI治療前1 d及治療1個月后1 d清晨外周血5 ml，T細胞亞群檢測：肝素抗凝的全血100 μl，加入10 μl CD45-FITC/CD4-RD/CD8-ECO/CD3-P15；NK細胞檢測：肝素抗凝的全血100 μl，加入20 μl CD45-PC5/CD3/CD16+56-PE。上述標本室溫避光靜置30 min后上機檢測，所有抗體購于美國Beckman coulter公司，采用流式細胞儀EPICS XL檢測，檢測方法按照說明書執行。

1.7療效評價 療效按RECIST1.1實體瘤評價標準分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)，疾病進展(PD)，CR+PR為有效，CR+PR+SD為控制。無進展生存期(PFS)指自治療首日至病變進展日；總生存期(OS)為自治療首日至死亡日或失訪日，均以月計算。隨訪截止時間：2015年6月。

1.8統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件包進行t檢驗和生存分析Kaplan-Meier法，Log rank法檢驗。

2 結 果

2.1CTC水平與T細胞亞群及NK細胞的關系 本試驗CTC水平在92～382，以其中位數198為分界點分為CTC高表達組和CTC低表達組。高表達組CD3+、CD4+顯著低于低表達組、CD8+顯著高于低表達組，CD4+/CD8+倒置，細胞免疫功能顯著低于CTC低表達組(P<0.001)；NK細胞顯著高于低表達組(P<0.001)。見表1。

表1 CTC表達水平與T細胞亞群及NK細胞的關系

2.2TKI治療前后CTC表達水平與T細胞亞群及NK細胞變化的關系 CTC高表達組治療前后T細胞亞群及NK細胞差異無統計學意義(P>0.05)，CTC低表達組CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+顯著升高，CD8+、NK水平顯著下降(P<0.05)，見表2。

表2 CTC高、低表達組治療前后T細胞亞群的變化

與治療前比較：1)P<0.05

2.3CD4+/CD8+與OS、PFS的關系 本組病例中位OS為15個月，1年生存率為60.6%，2年生存率為33.3%，3年生存率為12.1%。CD4+/CD8+比值<1為低表達組，≥1為高表達組。兩組OS差異有統計學意義(χ2=5.012,P=0.025)，見表3、圖1。本組病例PFS為6個月。CD4+/CD8+低表達和高表達組中位PFS差異有統計學意義(χ2=8.863,P=0.013)，見表4、圖1。

2.4NK細胞與OS、PFS的關系 NK細胞≥15.7%為高表達組，<15.7%為低表達組。NK細胞高表達和低表達組中位OS差異有統計學意義(χ2=17.958,P=0.000)，見表5、圖2。NK細胞高表達和低表達組中位PFS差異有統計學意義(χ2=15.401,P=0.000)，見表6、圖2。

表3 CD4+/CD8+不同表達組OS比較

與高表達組比較：1)P<0.05;表4同

表4 CD4+/CD8+不同表達組PFS比較

圖1 CD4+/CD8+表達水平與晚期NSCLC患者OS、PFS關系

圖2 NK表達水平與晚期NSCLC患者OS、PFS的關系

表5 NK不同表達組OS比較

與高表達組比較：1)P=0.000；表6同

表6 NK不同表達組PFS比較

3 討 論

CTC是一種從原發灶或轉移灶中脫落的腫瘤細胞，這些細胞可能經周圍的血管進入血液循環〔8〕，大部分因宿主的免疫系統、血流剪切力或自身凋亡而死亡。CTC存在于晚期肺癌患者外周血中，患者的細胞免疫功能受到嚴重抑制，無法及時清除循環系統中腫瘤細胞，少數有高度活力、高度轉移潛能的細胞存活下來〔9〕，穿過血管及淋巴管，與血管內皮黏附，定植于次級或遠處器官，實現腫瘤的轉移〔10〕。

肺癌患者外周血 T 細胞亞群和NK細胞活性的變化，是反映患者機體細胞免疫功能狀態和判斷療效的重要指標〔11〕。CD3+T 細胞通常代表機體總T 細胞數量，CD4+T細胞代表T 輔助細胞，是人體抗腫瘤免疫的重要組成部分，可以通過干擾素(INF)-γ介導的機制直接殺傷腫瘤細胞〔12，13〕，對細胞免疫起正調節作用。CD8+T 細胞則代表T 抑制細胞，抑制機體免疫應答，也對靶細胞有一定殺傷作用，起負調節作用。CD4+/CD8+比值可以反映機體細胞免疫功能狀態，比值降低表明機體細胞免疫功能降低，抗腫瘤能力減弱。研究顯示，經過TKI治療后NSCLC患者細胞免疫抑制狀態得到明顯改善，靶向治療改善了NSCLC患者細胞免疫調節功能〔7〕。老年晚期NSCLC患者體質差，病情復雜，多伴有并發癥，免疫功能低，特別是細胞免疫功能常處于低水平。

NK細胞是細胞免疫中非特異性成分，不依賴抗體和補體，不需預先活化即可直接殺傷腫瘤細胞，并能分泌細胞因子參與免疫調節，而且NK 細胞還具有適應性免疫的特性〔14〕。NK 細胞殺傷靶細胞主要是通過穿孔素和顆粒酶B引起靶細胞的裂解，同時也可被腫瘤壞死因子(TNF) 激活殺傷靶細胞〔15〕，是一類在早期抗腫瘤免疫機制中起重要作用的效應細胞。

綜上，老年NSCLC患者CTC表達水平與細胞免疫功能呈負相關，TKI治療使CTC低表達者免疫功能得到改善，且主要體現在細胞免疫功能上，CD4+/ CD8+低表達、NK細胞高表達患者能有更長的OS及PFS。由于TKI可改善晚期NSCLC患者的細胞免疫功能，且有效可能亦與免疫功能增強有關，對此需要進一步研究TKI改善NSCLC患者細胞免疫功能的機制。分子靶向藥物為老年晚期NSCLC的治療帶來了希望，還需要明確治療的優勢人群、發掘更多的治療靶點及相關的預后和預測標志物。

1姜宏寧，余 敏.吉西他濱單藥治療老年晚期非小細胞肺癌的療效分析〔J〕.臨床肺科雜志，2009；14(2)：196-7.

2Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics，2009〔J〕.CA Cancer J Clin，2009；59(4)：225-49.

3Azzoli CG，Baker S Jr，Temin S，etal.American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline update on chemotherapy for stage Ⅳ non-small-cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol，2009；27(36)：6251-66.

4Georgoulias V，Douillard JY，Khayat D，etal.A multicenter randomized phase Ⅱ efficacy study of vx-001，a peptide based cancer vaccine as maintenance treatment in advanced non-small-cell lung cancer：treatment rationale and protocol dynamics〔J〕.Clin Lung Cancer，2013；14(4)：461-5.

5Fiorelli A，Accardo M，Carelli E，etal.Circulating tumor cells in diagnosing lung cancer：clinical and morphologic analysis〔J〕.Ann Thorac Surg，2015；99(6)：1899-905.

6Punnoose EA，Atwal S，Liu W，etal.Evaluation of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer：association with clinical endpoints in a phase Ⅱ clinial trial of pertuzumab and erlotinib〔J〕.Clin Cancer Res，2012；18：2391-401.

7張金標，鄭 航，尤長宣，等.靶向治療后肺癌患者外周血T淋巴細胞亞群的表達變化及意義〔J〕.山東醫藥，2011；51(18)：55-6.

8Elshimali YI，Grody WW.The clinical significance of circulating tumor cells in the peripheral blood〔J〕.Diagn Mol Pathol，2006；15(4)：187-94.

9喬媛媛.循環腫瘤細胞及其與腫瘤轉移復發的相關性研究〔J〕.現代腫瘤醫學，2011；19(9)：1877-80.

10Paget JA，Restall IJ，Daneshmand M，etal.Repression of cancer cell senescence by PKCiota〔J〕.Oncogene，2012；31(31)：3584-96.

11Heidemann F，Schildt A，Schmid K，etal.Selectins mediate small cell lung cancer systemic metastasis〔J〕.PLoS One，2014；9(4)：923-7.

12Zhang S，Bernard D，Khan WI，etal.CD4+T-cell-mediated antiturnor immunity can be uncoupled from autoimmunity via the STAT4/STAT6 signaling axis〔J〕.Eur J Immunol，2010；39(5)：1252-9.

13Hu Z，Lin D，Yuan J，etal.Overexpression of osteopontin is 11880-eiated with more aggressive phenotypes in human non-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005；11(13)：4646-52.

14Sun JC，Beilke JN，Lanier LL.Adaptive immune features of natural killer cells〔J〕.Nature，2009；457(7229)：557-61.

15Fietta P，Delsante G.Focus on human natural killer cells〔J〕.Riv Biol，2009；102(2)：219-35.