microRNA-107在阿爾茨海默病患者血清中的表達及臨床意義

曾慶宏 劉 霞 莊愛霞 周 芳 于善花 姜建東 王傳淇 彭艷艷 張浩江 聶紅霞

(連云港市第二人民醫院神經內科，江蘇 連云港 222006)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經退行性疾病，表現為認知、語言、記憶等功能障礙〔1～3〕，是導致老年人癡呆的主要原因〔4〕。近年來一些新技術的開發應用，促進了蛋白組學的研究，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MSS)〔5〕,高效液相色譜與電感耦合等離子質譜(HPLC-ICP-MS)〔6〕，液相色譜-紫外光譜-質譜聯用技術(HPLCUV-MS)〔7，8〕,鳥槍法蛋白質組學〔9〕等對蛋白的分離、定性和定量的檢測，可能有助于新的AD生物標記物的發現，但仍缺乏特異性和敏感性均高的單一的診斷方法。microRNA是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的參與基因轉錄后水平調控的單鏈非編碼小分子RNA，主要功能是通過抑制靶mRNA翻譯或促使其降解的方式對基因表達起調控作用〔10〕，參與細胞周期調控及個體發育過程〔11～14〕。在神經系統中microRNAs調節不同發育階段及不同部位的病理生理條件下神經細胞的增殖、分化與凋亡，并對人類的認知和記憶能力的形成起重要作用〔15，16〕。有些microRNAs以與多聚核糖體結合的方式存在于神經元中〔17，18〕，對腦的生長發育表達出組織特異性和階段特異性。血清中存在著穩定的microRNAs表達〔19，20〕。本研究旨在分析microRNA-107在AD患者血清中表達。

1 資料和方法

1.1研究對象 2012年10月至2015年6月連云港市第二人民醫院住院及門診就診首次診斷AD的患者，根據病情程度分為輕度組和中度組各30例；根據年齡匹配設正常組30例：為健康體檢者，具有正常功能活動能力，無器質性腦病，神經系統檢查無異常，簡易精神狀態監測量表(MMSE)評分在28分以上。排除標準:(1)既往有腦血管疾病者；(2)有顱腦外傷者；(3)有中毒性、代謝性等腦病者；(4)診斷前進行藥物治療者；(5)有血液系統疾病者；(6)血管性及其他原因所致癡呆；(7)未知情同意者。記錄所有研究對象的性別、年齡、既往史(高血壓、糖尿病、冠心病等)、吸煙史、飲酒史及纖維蛋白原(Fg)、高半胱氨酸(HHcy)、C反應蛋白(CRP)、血脂等血液化驗指標。三組性別、年齡及既往史差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2AD診斷標準 根據2011年美國國家衰老研究所(NIA)和AD學會(AA)制定的診斷標準(NIA-AA診斷標準)，AD患者的癡呆分級根據MMSE和AD評定量表認知部分(ADAS-cog)量表。根據MMSE評分分為：輕度組(15分

1.3樣本采集 輕、中度組治療前采取靜脈血，正常組靜脈血來自來體檢中心健康體檢者，所有靜脈血提取血清后放入-80℃冰箱保存備用。

1.4總RNA提取 取100～200 μl低溫冷藏的每例血清樣本，置于冰上融化，且充分混勻。加入3倍體積的Trizol LS到樣本中，在震蕩器上充分混勻，室溫放置5～15 min進行變性處理。按等體積加入氯仿，振蕩器上充分混勻，室溫放置15 min，在4℃條件下，14 000 r/min離心15 min抽提RNA。

1.5芯片檢測 抽取每例輕、中度組患者的等量RNA，充分混勻后抽提RNA進行microRNA芯片檢測，并與正常組的microRNA芯片檢測結果比較，利用軟件找出差異microRNAs。

1.6逆轉錄 用Taqman microRNA逆轉錄試劑盒和microRNA特異性莖環結構逆轉錄引物進行microRNA逆轉錄反應，操作按照ABI的流程，進行部分調整，總反應體系15 μl。

1.7QT-PCR檢測 設計引物序列，以U6 snRNA 作為內參，應用QT-PCR把三組microRNA-107進行定量分析，然后進行相互比較。用2-ΔΔCT計算microRNA的表達量,每例樣本重復檢測3次。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t、χ2檢驗和多因素回歸分析。

表1 3組一般資料對比(n=30)

1)正常組與輕度組比較；2)正常組與中度組比較；3)輕度組與中度組比較

2 結 果

2.1基因芯片檢測結果 輕度組檢測出信號表達>500的差異microRNAs 35條，其中上調27條，下調8條，見圖1；中度組檢測出信號表達>500的差異microRNAs 34條，其中上調23條，下調11條，見圖2。輕度組與中度組共同表達>500的差異microRNAs 26條，其中microRNA-107在列。microRNA-107在輕度組、中度組均顯著下調microRNA(P<0.01)。

2.2MicroRNA-107 QT-PCR結果 見表2。輕度組、中度組血清中microRNA-107表達量較正常組明顯下降(P<0.01),與芯片結果一致；中度組血清中microRNA-107表達量較輕度組顯著下降(P<0.01)。

圖1 輕度組與正常組差異microRNAs聚類圖

圖2 中度組與正常組差異microRNAs聚類圖

表2 3組microRNA-107定量結果比較

ΔCT.同一個樣品目標基因和內參基因平均CT值的差值;ΔΔCT.特定目標基因的待檢樣品和校準樣品ΔCT的差值；與正常組比較：1)P<0.01；與輕度組比較：2)P<0.01

3 討 論

microRNAs與腫瘤〔21，22〕、心血管疾病〔23，24〕、糖尿病〔25〕、神經退行性疾病〔26〕的發生發展密切相關,與AD的關系也受到廣泛關注〔27～29〕。有研究者在AD的轉基因小鼠模型里檢測到對AD有影響的microRNAs〔30，31〕。MicroRNAs在細胞實驗中能調節淀粉樣前體蛋白(APP)的表達〔32～34〕及影響Aβ沉積〔35〕。Sohonrook 等〔36〕發現某些microRNAs促進了Aβ產生，而Aβ又可改變microRNAs表達，成為microRNAs網絡失衡的始發因子，MicroRNAs與Aβ之間存在一種極其復雜的聯系，在體內相互促進相互影響，從而影響著AD的發生發展。MicroRNA-125b被證明可引起tau蛋白高度磷酸化，其機制在于靶向抑制雙特異性磷酸酶(DUSP)6和蛋白磷酸酶催化亞基α亞型(PPP1CA)而促進tau蛋白磷酸化，研究同時發現micro-125b可損害小鼠聯合型學習〔37〕。Lau等〔38〕的研究也證明microRNA-132-3p通過調節tau蛋白的轉錄因子促進了AD的發展。可見，MicroRNAs從多種機制上參與了AD的發生、發展。

本研究結果說明microRNA-107下調可能影響AD的發生。MicroRNA-107是microRNA-15/107家族成員之一，這個家族的其他成員還包括microRNA-15,microRNA-16,microRNA-103,microRNA-195,microRNA-424,microRNA-497,microRNA-503,microRNA-646等，這些microRNAs的5′端都有相同的種子序列AGCAGC，正是由于這種5′端序列的同源性促使其在調控靶mRNA的轉錄后降解和翻譯抑制方面有相似的特性〔39〕。目前這個家族中microRNA-107已證實與AD的發生相關〔40〕，Nelson 等〔41〕發現AD和輕度認知功能障礙(MCI)的患者中microRNA-107表達水平下降，與本研究結果一致。Petra等〔42〕研究了血液中12種與AD有關的microRNAs，其中microRNA-107也表達下降。MicroRNA-107可能通過以下相關機制影響AD的發生發展：(1)Wang等〔43〕對不同階段AD患者腦組織中的RNA進行分析，發現AD進程中microRNA-107的表達出現不同程度減少，而淀粉蛋白前β位分解酶(BACE)1表達增加，從而出現相應的病理改變，該研究認為microRNA-107可通過與靶基因BACE1的3′端非翻譯區(UTR)區結合調控BACE1的表達，繼而增加APP水解后Aβ生成與沉積導致AD的發生，并可能通過調節BACE1參與加速該病的進展；(2)MicroRNA-107也可以誘導神經元細胞周期阻滯〔44〕，并重新進入細胞周期，重新進入細胞周期是AD發病的早期事件甚至發生在Aβ和神經纖維纏結(NFTs)形成之前〔45〕，導致AD的發生；(3)MicroRNA-107還通過降低控制APP和淀粉樣斑塊形成解聚素基質金屬蛋白酶(ADAM)10的表達來影響AD的發生〔46〕；(4)Peter等〔47〕還證實AD患者腦組織microRNA-107表達下降與老年斑及NFTs下降相關。當然，microRNA-107影響AD的機制還需要進一步的研究。

綜上，血清中microRNA-107可能間接反映腦組織內的microRNA-107表達變化，但AD患者血清中表達水平下降的原因和機制尚需進一步研究。microRNA-107可能會作為輔助診斷AD的一種潛在的生物標志物，為AD提供更全面的早期診斷及判斷預后指標，并且可能成為治療靶點，但microRNA-107表達水平與AD的診斷是否具有特異性，尚需進一步擴大樣本量進行驗證。

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