淫羊藿苷對骨質疏松性老年骨折模型愈合過程的影響

鄧 君 邱 波

(湖北第三人民醫院急診科，湖北 武漢 430000)

骨質疏松是一種與衰老密切相關的病理現象，臨床以骨量減少、骨組織結構退化為特征，導致骨的脆性增高，增加骨折風險。骨質疏松性骨折是骨強度下降導致的骨折，是骨質疏松最嚴重的后果。據統計，55%骨質疏松發生于老年人，其中約10%會發生骨折，嚴重威脅老年人身心健康和影響生活質量〔1～3〕。淫羊藿具有補益腎陽、強筋健骨等功效，常用于骨質疏松、骨折后期等疾病〔4,5〕。淫羊藿苷是淫羊藿最重要的有效成分，對體內外的成骨細胞均能有效進行干預，并對骨間充質干細胞的表達、分化、凋亡有多層次的影響〔6～8〕。本文旨在探討淫羊藿苷對骨質疏松性老年骨折愈合過程的影響。

1 資料與方法

1.1動物與藥物 15月齡，體質量(530±20)g，SPF級SD大鼠90只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔合格證號：SCXK(京)2016-0064〕。淫羊藿苷(廣州谷多生物科技有限公司)，溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液，低溫、避光保存。

1.2主要試劑與儀器 注射用青霉素鈉(400萬U/支，中諾藥業有限公司)；骨保護素(OPG)，免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒、鈣測定試劑盒、磷測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蘇木素-伊紅、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(天津市申泰化學試劑有限公司)；OLYMPUS光學顯微鏡(日本)；NORLAND EXCELL雙能X線吸收儀(美國NORLAND公司)；紫外光柵分光光度計752型(山東高密彩虹分析儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1骨質疏松性骨折大鼠模型制備 造模大鼠用維A酸以80 mg/kg進行灌胃，1次/d，連續灌胃3 w，建立骨質疏松模型；第4周時對大鼠進行骨密度檢測，驗證造模成功。所有造模大鼠35 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，固定在手術板上，碘伏消毒，右后腿中段前外側切口，人工造成右側脛骨中上段骨折，將1 mm克氏針從脛骨近端至遠端髓內固定，縫合傷口，造成骨質疏松性骨折模型，術后每日注射10萬U青霉素鈉，連續3 d。同時取30只SD大鼠，灌胃等量蒸餾水，同樣方法只有手術切口，不損傷脛骨，縫合傷口，作為假手術組。

1.3.2分組及給藥處理 手術后正常飼養，隨機分為假手術組、模型組和實驗組。30只/組。實驗組大鼠給予腹腔注射淫羊藿苷100 μg/kg；假手術組、模型組給予同體積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，1次/d，連續注射10 d。

1.3.3觀察指標 分別在術后第2、4、8、12周，各組隨機處死5只大鼠，取骨折處為中點長約1 cm股骨，收集標本，4%多聚甲醛固定，20%乙二胺乙酸(EDTA)脫鈣，石蠟包埋，切片。切片組織學觀察，分別進行HE染色和OPG免疫組織化學染色，采用圖像分析儀計算OPG蛋白陽性表達積分光密度值(IOD)。在2、4、8、12 w對大鼠進行X線吸收儀掃描，以骨折端為中心測量骨痂骨密度，并對左下肢進行股骨骨密度檢測。術后2、4、8、12 w，分別于處死前行心臟取血5 ml，常溫靜置2 h，低溫條件下3 000 r/min離心10 min，收集血清，測定血清鈣磷乘積及ALP。

1.4統計學方法 應用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1組織學HE染色結果 術后2 w，肉芽組織機化，出現軟骨島；與實驗組相比，模型組軟骨細胞數量、軟骨島面積較少。4 w時，模型組新生軟骨大量增多，未見網織骨形成；而實驗組除有新生骨增多，并有網織骨形成。術后第8周時，實驗組仍有肥大的軟骨細胞，開始形成大量骨小梁，間隙間可見毛細血管；而模型組有大量肥大的軟骨細胞，且骨小梁少而細。術后12 w，實驗組形成大量骨小梁，可見肥大的軟骨細胞；而模型組骨小梁較少。假手術組骨骼正常。見圖1。

圖1 模型組、實驗組不同時期HE染色結果(×100)

2.2OPG免疫組織化學染色結果 術后2 w，實驗組可見骨膜內增生細胞增多，成骨細胞、肉芽組織中的成纖維樣細胞及新生軟骨細胞陽性廣泛表達；而模型組陽性細胞著色淺，且表達數量明顯較少。術后第4周，實驗組上述細胞陽性持續表達，骨痂周圍的成骨細胞數量明顯高于模型組。術后第8周，實驗組骨組織中陽性細胞數與陽性程度與前幾周比有所下降，但軟骨細胞陽性表達仍高于模型組。術后第12周，實驗組軟骨細胞著色呈陰性，多數肥大，陽性著色者為成骨細胞和周圍的類骨質，而模型組的表達類似，但多數為軟骨細胞，著色較淺。術后2、4、8、12 w，模型組OPG免疫組化圖像IOD值分別為(155.04±2.62)、(124.25±7.48)、(133.58±4.22)、(84.67±4.20)，實驗組分別(210.01±6.29)、(215.73±9.42)、(210.83±10.12)、(115.94±9.48)；在相同的時間段，與模型組相比，實驗組IOD值明顯較高(P<0.05)。

2.3不同時間大鼠骨密度測定結果 在相同的時間段，與模型組相比，實驗組骨痂骨密度明顯較高(P<0.05)；而左側股骨骨密度兩組在相同時間差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組相比，模型組和實驗組左側股骨骨密度均降低(P<0.05)。見表1。

2.4大鼠血清鈣磷乘積及ALP檢測結果 在相同的時間段，與模型組相比，實驗組大鼠血清鈣磷乘積略高，但差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組ALP水平明顯高于模型組及假手術組(均P<0.05)。見表2。

圖2 模型組不同時期OPG免疫組織化學染色結果(×100)

表1 不同時間段各組骨密度測定結果

與假手術組相比：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

表2 不同時間段各組血清鈣磷乘積及ALP檢測結果

與實驗組比較：1)P<0.05

3 討 論

骨質疏松臨床治療主要采用雌激素類、降鈣素和鈣制劑等，但副作用較大。骨質疏松性骨折屬于中醫中的“骨痿、骨疲”，與中醫的“腎”有非常密切的關系。中醫對骨折的治療和促進骨折愈合方面有豐富的經驗，其中以補腎理念為重要指導思想。淫羊藿小檗科植物，主在藥用成分為淫羊藿苷，藥理研究證實，淫羊藿能加速刺激骨髓細胞DNA的合成，刺激成骨細胞生長，對成骨細胞生長增殖具有一定的促進作用。動物實驗研究表明，淫羊藿提取液對成骨細胞增殖作用有影響，且隨劑量增加促進作用越強〔9,10〕。有研究報道〔11～13〕，淫羊藿苷具有誘導骨髓間充質干細胞成骨分化、抑制成脂分化的功能，可以促進成骨細胞的增殖分化。骨折修復的核心是成軟骨細胞、成骨細胞前體的聚積、增殖和分化，OPG為骨代謝過程中骨再生的指標。研究顯示，OPG具有抑制破骨細胞形成、分化、存活的功能，并誘導破骨細胞凋亡。本研究結果顯示：實驗組軟骨生成及軟骨內成骨過程較模型組明顯較快，而且在各個相同時間點，實驗組蛋白陽性表達的IOD值均較高，說明淫羊藿苷增加了軟骨細胞的分化、增殖，促進成骨細胞和成熟軟骨細胞OPG的表達，使骨形成加快，骨小梁形成增多，從而促進愈合。

ALP主要來源于骨組織，主要促進磷酸鈣的生成而沉淀于骨組織內，而血液中鈣磷含量又直接影響骨的鈣化與溶解。本研究通過檢測ALP及鈣磷乘積水平發現，淫羊藿苷可以提高成骨活動，促進骨質疏松骨折愈合。

本實驗結果提示，淫羊藿苷可以改善骨質疏松老年骨折大鼠愈合過程，這可能是通過提升軟骨內成骨，加快礦化速度，增加骨痂和全身骨密度，促進OPG的表達，從而加快老年大鼠骨質疏松性骨折的愈合過程。

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